Biochemische Charakterisierung der rekombinanten HMTn CG5358, CG6554 und CG6563

2.2.6.1 Klonierung

Um experimentell zu bestätigen, dass die drei identifizierten Proteine tatsächlich für die ent-sprechende HMT-Aktivität verantwortlich sind, sollten sie kloniert, in E. coli exprimiert und gereinigt werden. Für die Klonierung wurde in der Flybase (http://flybase.bio.indiana.edu/) nach cDNAs gesucht und die entsprechenden Klone von Research Genetics, Huntsville, USA bestellt (Tab. 2-2).

Tabelle 2-2. cDNA-Klone der identifiziertenProteine.

Gen cDNA-Klon

cg5358 LD30574

cg6554 LD38136

cg6563 LD34544

Die cDNAs wurden mit spezifischen Primern für das 3’- und 5’-Ende amplifiziert, wobei für die darauffolgende Insertion der cDNAs in pBluescript und bakterielle Expressionsvektoren flankierende Restriktionsschnittstellen eingeführt wurden. Die Ergebnisse der PCR-Ansätze sind in Abb. 2-21 schematisch dargestellt.

2.2.6.2 Expression und HMT-Aktivität

Für die Expression in E. coli wurden die Vektoren pet19b (Stratagene) und pGEX2TKN (Sauer et al., 1995) verwendet. Die cDNAs wurden in die Expressionskassetten der Vektoren inseriert. Dies ermöglicht es, Fusionsproteine zu exprimieren, die sich aus NH2-terminal fusi-oniertem Polyhis (His₁₀; pet19b) oder GST (pGEX2TKN) und den HMTn zusammensetzen.

Als Expressionsstamm wurde E. coli BL21(DE3) verwendet. Bei den GST-markierten Proteinen war die Expressionsrate nicht zufrieden stellend, wohingehend die His10-markierten Proteine in ausreichender Menge produziert wurden (Daten nicht gezeigt). Es wurde daher nur mit den His10-markierten Proteinen weitergearbeitet. Die Proteine waren nach Aufschlss der Zellen in der löslichen Fraktion und wurden in nativem Zustand durch einen einfachen Reini-gungsschritt über Nickel-Affinitätschromatographie isoliert. Die Reinheit der Proteine lag zwischen 70-95%, was zur Bestimmung ihrer HMT-Aktivität ausreichte.

Die gereinigten Proteine wurden mit verschiedenen Histonsubstraten und radioaktiv mar-kiertem SAM inkubiert und ihre enzymatische Aktivität fluorographisch und quantitativ be-stimmt (Abb. 2-22 und Abb. 2-23). CG5358 zeigte gegenüber rekombinantem H3 die höchste Aktivität. H3 in Oktameren wurde dagegen sehr viel geringer methyliert, oligonukleosomale Histone überhaupt nicht. Alle drei HMTn vermögen nicht, oligonukleosomale Histone zu methylieren. Offensichtlich verhindert die komplexierte DNA die Erkennung des Substrat-Histons oder die enzymatische Reaktion an sich. Im Gegensatz zu CG5358 methylierten CG6554 und CG6563 ihr Zielhiston H4 auch in Oktameren. Außerdem zeigten sie eine hö-here Substratvariabilität. Beide konnten freies H2A ebenso effektiv markieren wie freies H4.

Wenn aber alle Histone gemeinsam angeboten wurden, wurde H4 vorgezogen. CG6563 me-thylierte zusätzlich rekombinantes H3 signifikant.

Dieses Ergebnis überrascht, da Vertebratenenzyme Histone im Kontext von Chromatin methylieren, um die Transkription zu aktivieren (Strahl et al., 2001). Vorausgesetzt, dass die identifizierten Proteine (zumindest CG5358 und CG6554) wie ihre Säugerhomologe bei die-sem Prozess eine Rolle spielen, sollten sie in der Lage sein, Oligonukleosomen als Substrat zu erkennen und zu methylieren (siehe auch Diskussion). Die drei Proteine liefen in Gelfiltrationsläufen nicht als Monomer sondern bei höherem Molekulargewicht in Komplexen (Abb. 2-14, Abb. 2-15 und Abb. 2-17). So kann es möglich sein, dass weitere Komponenten der Komplexe für die Erkennung und Bindung von Nukleosomen zuständig sind. Bei einem Test verschiedener Fraktionen fortgeschrittener Reinigungsschritte, in denen diese

Komponenten noch vorliegen sollten, wurde jedoch bei keinem der drei Proteine HMT-Aktivität gegenüber Oligonukleosomen festgestellt (C. Beisel, Daten nicht gezeigt).

Abbildung 2-22. Charakterisierung der HMT-Aktivität von rekombinantem CG5358 und CG6554.

Die Proteine wurden mit je 1 µg verschiedener Histonsubstrate (einzelne rekombinante Histone (rH) H3, H2B, H2A, oder H4, Histonmix (HM), aus Drosophila isolierte Histon-Oktamere (Okt) und zwei verschiedene Präparationen von Oligonukleosomen (Nuk1, Nuk2)) und 1 µCi [³H]-SAM für 1 h bei 30!°C inkubiert. Die HMT-Aktivität wurde fluorographisch und quantitativ bestimmt. Oben, Coomassie gefärbte SDS-Polyacrylamidgele der HMT-Aktivitätstests. Mitte, Fluorogramme. Unten, Quantifizierung der inkorporierten ³H-markierten Methylgruppen. Für die Quantifizierung wurden die Proben mittels SDS-PAGE aufgetrennt, die Proteine auf PVDF-Membran transferiert und mit Coomassie angefärbt.

Die Histonbanden wurden ausgeschnitten und die Aktivität im Szintillationszähler bestimmt. Links der Gele, relatives Molekulargewicht in kDa. Rechts, Markierung der Proteine.

Abbildung 2-23. Charakterisierung der HMT-Akti-vität von rekombinantem CG6563. CG6563 wurde mit verschiedenen Histonsubstraten (einzelne re-kombinante Histone (rH) H3, H2B, H2A, oder H4, Histonmix (HM), aus Drosophila isolierte Histon-Ok-tamere (Okt) und Oligonukleosomen (Nuk)) und 1 µCi [³H]-SAM für 1 h bei 30!°C inkubiert. Die HMT-Aktivität wurde fluorographisch und quantitativ be-stimmt. Oben, Coomassie gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel der Reaktionen. Mitte, Fluorogramm. Unten, Quantifizierung der inkorpo-rierten ³H-markierten Methylgruppen. Für die Quan-tifizierung wurden die Proben mittels SDS-PAGE aufgetrennt, die Proteine auf PVDF-Membran trans-feriert und mit Coomassie angefärbt. Die Histonban-den wurHistonban-den ausgeschnitten und die Aktivität im Szintillationszähler bestimmt. Links des Gels, relati-ves Molekulargewicht in kDa. Rechts, Markierung der Proteine.

2.2.6.3 Monomer oder Oligomer?

Um herauszufinden, ob die rekombinanten Proteine als Monomere oder als Oligomere vorlie-gen, wurden Aliquots der gereinigten Proteine über eine analytische Gelfiltration aufgetrennt.

In Übereinstimmung zu ihrer Identifizierung eluierten die drei Enzyme in oligomeren Kom-plexen, die ein weit höheres Molekulargewicht besitzen als die Monomere (Abb. 2-24).

CG5358 eluierte bei etwa 420 kDa, CG6554 bei etwa 320 kDa und CG6563 bei etwa 300 kDa. Mit Ausnahme von CG5358 stimmen die Werte mit den früheren Beobachtungen über-ein. Aufgrund der Molekulargewichte der Proteine errechnet sich für CG6554 (43 kDa) ein oktamerer und für CG6563 (60 kDa) ein pentamerer Komplex. Bei CG5358 erhält man bei Vergleich des Elutionsverhaltens des rekombinanten mit dem des gereinigten Proteins eine Diskrepanz von etwa 60 kDa. So läuft das rekombinante Proteine auf der Höhe eines

hepta-meren Homo-Oligomers während die früheren Ergebnisse auf ein Oktamer oder ein Heptamer mit zusätzlicher heterologen Untereinheit schließen lässt.

Abbildung 2-24. Die rekombinanten Proteine bilden homooligomere Komplexe. Aliquots der ge-reinigten Proteine wurden für 30 min bei 30 °C inkubiert und anschließend auf die analytische Gel-filtrationssäule Superdex200HR10/30 geladen. Die Säule wurde zuvor mit dem Laufpuffer (20!mM Tris, 1 mM MgCl2, 0,25 mM EDTA, 10% Glycerin, 1 mM DTT, 150mM NaCl, pH!7,9) äquilibriert. Es wurden Fraktionen von 0,5 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden durch SDS-PAGE aufge-trennt und mit Coomassie gefärbt. Oben ist das Elutionsprofil eines Gelfiltrationsstandards angege-ben. * weist auf die Position von mitgereinigten Proteinkontaminanten hin.