Biochemische Charakterisierung der Myosin-Motordomäne .1 Heterologe und homologe Proteinexpression

Als Voraussetzung für die biochemische Charakterisierung der Mcs1-Myosin-Motordomäne (MMD) wurde versucht, rekombinantes Mcs1-Protein herzustellen. Für die Proteinexpression wurde zunächst ein E. coli Expressionssystem verwendet. Das gewonnene Protein sollte durch Nickel-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Dazu wurde der offene Leserahmen des mcs1 Gens ohne die Region, die für die Chitinsynthase-Domäne kodiert, in den Expressionsvektor pET15b kloniert (Mcs1MMD+linker bzw. pET15b-Mcs1MMD-linker). Die mcs1-Sequenz enthielt dabei auch die Sequenz, die für die Linker-Region bis zur ersten Transmembrandomäne, kodiert. Die Expression wurde über einen T7-Promotor mit IPTG induziert und als Expressionsstamm wurden E. coli BL21-Zellen verwendet. Leider konnten His-Mcs1MMD+linker und His-Mcs1MMD-linker in nur sehr geringen Mengen produziert werden (nicht gezeigt). Zudem waren beide Fusionsproteine unlöslich. Dadurch wurden Variablen wie die Inkubationstemperatur, IPTG-Konzentration, sowie die Induktionsdauer verändert, was jedoch nicht zu dem gewünschten Ergebnis führte (nicht gezeigt).

Daher wurde zusätzlich versucht, rekombinante Mcs1-Proteine aus U. maydis zu gewinnen.

Dazu wurden die Stämme FB2Pcrg6xHisMcs1MMD+ und –linker und die Stämme FB2PcrgHAMcs1MMD+ und –linker generiert. Durch Induktion des induzierbaren crg-Promotors können Fusionsproteine nach Mediumwechsel zu Arabinose-enthaltendes Medium in großen Mengen in U. maydis synthetisiert werden. Auch die Verwendung dieses Expressionssystems und die anschließende Proteinaufreinigung über Nickel-NTA-Affinitätschromatographie, führten zu keiner erfolgreichen Gewinnung ausreichender Mengen Mcs1MMD-Proteine. Daher wurden für die in 2.12.2 und 2.12.3 beschriebenen Versuche Alternativen zu gereinigtem Protein angewendet.

2.12.2 Charakterisierung der Coiled coil Region mittels Gelfiltration

Ein Charakteristikum verschiedener Myosinklassen ist die Bildung von Dimeren durch so genannte Coiled coil Regionen (Park et al, 2006; Schwaiger et al, 2002). Eine

Aminosäure-Sequenzanalyse durch das Programm „Coils2“

(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) ergab, dass die mcs1-Linkerregion für eine solche alpha-helikale Struktur kodiert (Abb. 32). Das Programm vergleicht dabei die Mcs1-Proteinsequenz mit Sequenzen, von denen bereits bekannt ist, dass sie in der Lage sind

doppelsträngige Coiled coils zu bilden. Aus einem Ähnlichkeitswert wird dann die Wahrscheinlichkeit für die Bildung eines Coiled coil berechnet (Abb. 32).

Abb. 32. Graphische Darstellung der „Coils2“-Analyse. Die Coiled coil Region wurde durch eine Proteinsequenzanalyse der As 721 bis 910 der Mcs1-Sequenz durch das Programm „Coils2“

(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.

html) ermittelt. Dabei wird die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines Coiled coils berechnet.

Der potentielle dimere Zustand von Mcs1 sollte mittels Gelfiltration untersucht werden. Da eine Aufreinigung rekombinanten Mcs1-Proteins nicht möglich war (vgl. 2.12.1), wurden Gesamtzellextrakte aus U. maydis Kulturen analysiert. Dazu wurden die Stämme FB2PcrgHAMcs1MMD+linker und FB2PcrgHAMcs1MMD-linker verwendet. Durch Induktion des induzierbaren crg-Promotors durch Mediumwechsel in Arabinose-enthaltendes Medium, erfolgte eine starke Überexpression der gewünschten Gensequenz. Das resultierende rekombinante Fusionsprotein HA-Mcs1MMD+linker (As 1-927) hatte ein vorhergesagtes Molekulargewicht von ~108 kDa. Das erwartete Molekulargewicht von HA-Mcs1MMD-linker (As 1-701) betrug ~83 kDa. Da angenommen wurde, dass die Ausbildung von Dimeren über die identifizierte Coiled Coil Region erfolgt, wurden Unterschiede im Laufverhalten der Proteine in der Gelfiltrationssäule erwartet.

Die einzelnen Fraktionen wurden durch das Äkta-System gesammelt und anschließend durch Western-Blot Analyse auf die Anwesenheit von Mcs1 hin untersucht. Das ungefähre Molekulargewicht der Mcs1-haltigen Fraktionen wurde dabei anhand der Eichgeraden bestimmt (Abb. 33A).

Die Untersuchung der einzelnen Fraktionen ergab nach Gelfiltrationsläufen mit HA-Mcs1MMD+linker (+ Coiled Coil; ~110 kDa), dass dieses Protein die Eigenschaft besitzt als Dimer zu laufen. Es konnte ein „peak“ ermittelt werden, der einem Elutionsvolumen von Ve=11,56 entspricht. Dies wiederum kann einem Molekulargewicht von etwa 230 kDa und somit einem Dimer zugeordnet werden. Ein zweiter „peak“ wurde bei Ve=12,81 detektiert.

Mit einem berechneten Molekulargewicht von etwa 120 kDa könnte dieser „peak“ einer als Monomer-laufenden Motordomäne zugeordnet werden (Abb. 33B oben).

Abb. 33. Bestimmung des Elutionsvolumens der Mcs1MMD +/- linker mittels Gelfiltration. (A) Superdex 200 Kalibrierungskurve mit Angabe der Positionen der verwendeten Standardproteine: Vitamin B12 (1,35 kDa), Myoglobin (17 kDa), Ovalbumin (44 kDa), γ-Globulin (158 kDa) und Thyroglobin (670 kDa). Die Kalibrierung wurde viermal durchgeführt, davon einmal im Hochsalzpuffer. Die blau gefärbten Linien geben die ermittelten Elutionsvolumen für HA-Mcs1MMD+linker, von ~120 kDa bzw. ~240 kDa, an. (B) Western-Blot Analyse der Fraktionen 39 bis 52 eines repräsentativen Gelfiltrationslaufes. Oben: HA-Mcs1MMD+linker (+ Coiled Coil;

~110 kDa): Es sind zwei „peaks“ sichtbar. Der erste „peak“ entspricht einem Elutionsvolumen von 11,56 (~ 232,6 kDa) was einem Dimer entsprechen könnte. Der zweite „peak“ ist bei einem Volumen von 12,81 (120,9 kDa), das einem Monomer entsprechen könnte. Unten: HA-Mcs1MMD-linker (-Coiled Coil; ~83 kDa):

Es ist nur ein „peak“ sichtbar. Dieser entspricht einem Elutionsvolumen von 12,81 (120,9 kDa) und könnte einem Monomer entsprechen.

Um zu überprüfen, ob die Dimerausbildung auch ohne Coiled Coil Region erfolgt, wurden Gelfiltrationsläufe mit der Kontrolle HA-Mcs1MMD-linker (-Coiled Coil; ~83 kDa) durchgeführt. Dies stellte sich als schwierig heraus, da dieses Protein die Eigenschaft besitzt, große Aggregate auszubilden (s. Abb. 33B unten). Um der Aggregatbildung entgegen zu wirken, wurde die U. maydis Kultur in einem Hochsalzpuffer aufgenommen und analysiert.

Es konnte nur ein „peak“ detektiert werden, was auf ein monomeres Protein hindeuten könnte (Abb. 33B unten).

2.12.3 Untersuchung zur Aktinbindung mittels Co-Sedimentation

Einige Myosine, wie Myo2p aus S. cerevisiae, weisen die Eigenschaft auf, in Abwesenheit von ATP fest an F-Aktin zu binden (Reck-Peterson et al, 2001). Im Gegensatz dazu besitzen andere Myosine, wie Myo5a aus G. gallus und M. musculus, in Anwesenheit von ATP eine hohe Affinität zu Aktin (Reck-Peterson et al, 2001). Takeshita et al. (2005) konnten bereits die Bindung der Myosin-Motordomäne an Aktin an CsmA von A. nidulans nachweisen. Um zu überprüfen, ob auch die Mcs1-Motordomäne mit Aktin interagiert und welchen Einfluss die Zugabe von ATP auf die Reaktion hat, wurden Co-Sedimentations-Experimente

Abb. 34. Überprüfung der Bindung der Mcs1-Myosin-Motordomäne an Aktin mittels Co-Sedimentation. Die Mcs1-Motordomäne incl.

Linkerregion (As 1-927) wurde mittels in vitro Translation hergestellt und mit Aktin in Ab- und Anwesenheit von ATP ermittelt. Nach der Zentrifugation wurden Aliquots von Überstand (Ü) und im gleichen Volumen gelösten Pellet (P) auf eine SDS-Gel aufgetragen. Mittels Immun-Blot wurden die Motordomäne (anti-His) und Aktin (anti-Aktin) mit den entsprechenden Antikörpern detektiert.

Da, wie oben beschrieben, die verschiedenen Versuche zur Aufreinigung rekombinanter Myosin-Motordomänen nicht durchführbar waren, wurde das Mcs1-Motorprotein mit Hilfe des „TNT^® Quick Coupled Transcription/Translation“ Systems zellfrei synthetisiert (s. 4.12).

Das System beinhaltet alle Komponenten für eine erfolgreiche gekoppelte Transkription/Translation in einem Retikulozyten Lysat. Da die in vitro RNA-Synthese durch eine T7 RNA Polymerase erfolgt, wurde das Plasmid pET15b-Mcs1MMD+linker, das einen T7-Promotor enthält, verwendet. Das in vitro Translationsprodukt wurde nach der Durchführung auf Expression, Menge des synthetisierten Proteins und Löslichkeit nach einstündiger Zentrifugation bei 100.000 g mittels Western-Blot Analyse überprüft. Es konnten nur sehr geringe Mengen des Proteins 6xHis-Mcs1MMD+linker mit Hilfe des Systems synthetisiert werden, jedoch war die gesamte hergestellte Proteinmenge löslich (nicht gezeigt), so dass die Co-Sedimentationsexperimente durchgeführt werden konnten. Das für den Versuch benötigte F-Aktin wurde mit Hilfe des „Actin Binding Protein Biochem Kits“

nach Herstellerangaben hergestellt. Anschließend wurde das nach Ultrazentrifugation erhaltende F-Aktin-Pellet in einem ATP-freien Puffer resuspendiert. Dieser Puffer enthielt Phalloidin, ein hochtoxisches Alkaloid des weißen Knollenblätterpilzes (Amanita phalloides).

Durch dessen Zugabe wird die Depolarisierung der Aktin-Filamente gehemmt und somit Aktin in Abwesenheit von ATP stabilisiert (http://en.wikipedia.org/wiki/Phalloidin).

Nach Co-Inkubation des synthetisierten Proteins mit F-Aktin in Anwesenheit von Apyrase, einem Enzym, das die Hydrolyse von ATP in AMP und anorganisches Phosphat katalysiert, bzw. ATP, wurde der Reaktionsansatz nach Ultrazentrifugation in eine Überstand und eine Pellet-Fraktion getrennt. Da die Mcs1-Motordomäne am N-terminalen Bereich an einen 6-fachen Histidinrest fusioniert war, konnte die Gegenwart von 6xHis-Mcs1MMD+linker im Überstand oder der Pellet-Fraktion mittels Western-Blot Analyse nachgewiesen werden. Die Bindung der Myosin-Motordomäne an phalloidin-stabilisiertes F-Aktin wurde in allen durchgeführten Experimenten erfolgreich nachgewiesen (Abb. 34). Versuche zum Einfluss von ATP auf die Aktinbindung zeigten jedoch widersprüchliche Ergebnisse. Zum einen

konnte, wie in dem repräsentativen Western-Blot dargestellt (Abb. 34), die Ablösung des Myosinkopfes vom Aktin-Filament in Anwesenheit von ATP ermittelt werden. Zum anderen, wurde in anderen Versuchsansätzen die feste Bindung an F-Aktin, trotz Zugabe von ATP, beobachtet (nicht gezeigt).