Biochemische Analyse ausgewählter FloA-Domänen

2.3.1 Bestimmung von Ligandenbindungskonstanten mittels Fluoreszenz-Spektroskopie

Nachdem die Ergebnisse aus dem Flokkulationstest mit chimären FloA-Domänen ergaben, dass die Flo10A^5SD-Domäne zwar eine niedrigere maximale Flokkulationsrate im Vergleich zu Flo5A, dafür aber eine höhere Affinität gegenüber freier Mannose und Glukose aufweist, sollte dieses Ergebnis zusätzlich durch in vitro Test bestätigt und genauer quantifiziert werden. Auch die deutlich schwächere Affinität von Flo10A sollte auf diesem Wege genauer bestimmt werden. Flo5A wurde während dieser Messungen als Positivkontrolle verwendet, da entsprechende Messungen bereits durchgeführt worden waren (Veelders et al., 2010). Als Negativkontrolle sollte die Subdomänen-deletierte Flo5A^∆SD-Domäne dienen, nachdem für diese in vivo keine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Um die genaue Affinität dieser Adhäsionsdomänen gegenüber ausgewählten Sacchariden bestimmen zu können, wurden diese zunächst in E. coli hergestellt, gereinigt, und anschließend mittels Fluoreszenz-Spektroskopie die Dissoziationskonstanten ermittelt. Als Saccharide wurden D-Mannose, α-1,2-Mannobiose, D-Galaktose und D-Glukose verwendet. Erstere waren dabei für den Vergleich zwischen den in vivo gemessenen Flokkulationsraten und den in vitro bestimmten Dissoziationskonstanten interessant, da während der Zell-Zell Adhäsion Mannose, insbesondere α-1,2-Mannobiose, in der Zellwand benachbarter Zellen gebunden wird. Für Galaktose wird spekuliert, dass dieses Glykan als Ligand bei der Adhäsion an Agar dienen könnte. Glukose spielt für die „NewFlo-Type“ Flokkulation, wie sie beispielsweise von LgFlo1 vermittelt wird, eine Rolle und sollte zusätzlich als Test dienen, ob sich durch den Austausch der Subdomäne auch das Ligandenspektrum von Flo10A^5SD verändert hatte da Flo5A Glukose nur unspezifisch bindet.

Die Herstellung der Proteine erfolgte mit dem pET-System, welches auf der Expression durch die virale T7 RNA-Polymerase beruht (Studier and Moffatt, 1986). In diesem System befindet

sich eine Kopie des viralen T7 RNA-Polymerase Gens im Genom der E. coli-Wirtszellen, welches unter der Kontrolle des lac-Promotor und lac-Operators steht. Das Gen des zu synthetisierenden Proteins befindet sich dagegen auf einem pET28a-Vektor und steht seinerseits unter der Kontrolle des T7-Promotors und des lac-Operators. Nimmt die Zelle das zu Laktose analoge IPTG auf, bewirkt dieses eine Konformationsänderung des lacI-Repressors am lac-Operator, wodurch die Transkriptionsinhibierung des lac-Promotors als auch des T7-Promotors aufgehoben wird. Letztendlich erfolgt durch die Bindung der T7 RNA-Polymerase an den T7-Promotor die Synthese des gewünschten Proteins. Die FLOA-Gensequenzen wurden dementsprechend in den pET28a-Vektor inseriert. Dabei wurde die Ligation so durchgeführt, dass das später synthetisierte Protein mit einem N-terminalen His-Tag versehen war mit dessen Hilfe die nachfolgende Aufreinigung stattfand. Die Synthese fand danach in dem E. coli-Stamm Shuffle^® T7 statt und wurde durch 1 mM (Endkonzentration) IPTG induziert. Nach der Synthese wurden die E. coli-Zellen abzentrifugiert, mit Hilfe eine French-Press aufgeschlossen, und das gewünschte Protein zunächst in einer Affinitätschromatographie mit Ni-NTA vom Rest der Zellproteine getrennt.

Bei diesem Schritt wurde das His-Tag zunächst durch Nickel gebunden und danach in einem Imidazol-Gradienten bis zu 500 mM wieder vom Säulenmaterial gelöst. Das Protein wurde aufgefangen, aufkonzentriert, und in einer Größenausschlusschromatographie sortiert.

Monomeres Protein wurde dann erneut aufkonzentriert, die Konzentration spektrophotometrisch bestimmt und eine mit DTT reduzierte Probe des Proteins auf ein 10 %-iges SDS-Gel aufgetragen um anhand der Größe festzustellen, ob es sich um das erwartete Protein handelte (Abb. 2.9, Tab. 2.5).

Tab. 2.5: Physikalische Parameter der in E. coli synthetisierten FloA-Domänen. Die Angaben dienten u.a.

dazu, nach der Aufreinigung aus E. coli die Menge des jeweils erhaltenen Proteins spektrophotometrisch zu bestimmen, woraus sich die Ausbeute berechnen lies.

Protein Molekulargewicht [kDA]

Extinktionskoeffizient [M^-1cm^-1]

Ausbeute

[mg Protein / L Kultur]

Flo5A^AS23-271 29,1 52300 1,5 - 0,8

Flo5A^ΔSD 25,4 45060 0,6

Flo10A^AS23-299 32,2 45435 0,1 - 0,05

Flo10A^5SD 29,2 50810 2,1 - 1,5

Flo5A Flo5A^ΔSD Flo10A Flo10A^5SD

Formel I:

Abb. 2.9: Auftragung einer Probe der in E. coli synthetisierten Proteine auf 10 %-ige SDS-Gele nach der Größenausschlusschromatographie. Dadurch sollte festgestellt werden, ob es sich um das erwartete Protein handelt, was durchweg bestätigt werden konnte. Als Größenstandard wurde der PageRuler™ Prestained Protein Ladder der Firma Thermo Fisher Scientific Inc. verwendet.

Nach der Aufreinigung der Proteine aus E. coli wurde deren Affinität zu den bereits erwähnten Sacchariden in einer Fluoreszenz-Titration, basierend auf der Fluoreszenz intrinsischer Tryptophane, gemessen. Dabei wurden bestimmte Mengen des Saccharid einer Proteinlösung zugegeben, und die Löschung der Fluoreszenz gemessen. Diese kommt dann zustande, wenn sich der Ligand und ein Tryptophan in räumlicher Nähe zueinander befinden.

Die Anregungsenergie des Tryptophans kann dabei auf den Liganden übertragen werden, welcher selbst jedoch nicht fluoresziert wodurch es zur Fluoreszenzlöschung kommt. Die prozentuale Fluoreszenzlöschung, im Vergleich zur Fluoreszenz ohne Zugabe eines Liganden, wurde dann gegen die Konzentration des Saccharids mit Hilfe des Programms „Graph Pad Prism 5“ aufgetragen (Abb. A1, siehe Anhang). Mit diesem wurde auch die Dissoziationskonstante Kd in einem nicht-linearen Fit, unter der Erwartung einer spezifischen Bindung an eine Bindungsstelle, mit Hilfe von folgender Formel berechnet:

𝑌= ^Ymax₍ ^{× X}

𝐾𝑑 + 𝑋)

Y = Prozentualer Fluoreszenzquench, Ymax = Maximaler Fluoreszenzquench X = Ligandenkonzentration, Kd = Dissoziationskonstante

k∆A 130 - 100 - 70 - 55 - 40 -

35 - 25 - 170 -

Die gleichen Messwerte wurden darüber hinaus in Form eines Scatchard-Plots aufgetragen.

Bei einem nicht-allosterischen Bindungsverhalten wird dabei eine abfallende Gerade erwartet, was bis auf die Messung von Flo10A mit Galaktose immer zutraf (siehe Anhang A1a-d). Die mit Hilfe der Fluoreszenz-Spektroskopie gemessenen Dissoziationskonstanten sind in Tab. 2.6 und in Abb. 2.10 zusammengefasst.

Tab. 2.6: Dissoziationskonstanten der aufgereinigten Flo-Adhäsionsdomänen zu ausgewählten Sacchariden. Die Kd-Werte wurden mit Hilfe von Fluoreszenz-Spektroskopie ermittelt. Für jede Protein-Saccharid Kombination wurden jeweils drei unabhängige Messungen durchgeführt. Bei den Messungen Flo5A^∆SD mit D-Galaktose, sowie Flo10A mit α-1,2-Mannobiose konnten jedoch nur zwei, bzw. eine Messung ausgewertet werden. Zusätzlich sind die entsprechenden Standardabweichungen angegeben. Die Messung Flo10A mit D-Galaktose ergab bis 300 mM Galaktose eine Gerade, wodurch die Dissoziationkonstante mit mindestens 150 mM angegeben ist. * Einzelmessung. ** Zwei Messungen.

Protein D-Mannose