7.7 BIACORE-E XPERIMENTE
7.7.3 Biacore-Bindungsstudien
Am BIACORE 3000 können drei verschiedene Injektions-Arten benutzt werden. Während beim Quickinject (QI) ein zusätzlicher Verbrauch von 10 µL pro Injektion benötigt wird, verbrauchen die Injektionen Inject (I) 30 µL und Kinject (KI) 40 µL mehr.
Das zur Verfügung stehende CD4 [7.2.2] lag in einem Histidin-Puffer vor. Da das Histidin während der Amin-Kupplung schneller an die aktivierte Matrix bindet als das Protein, mußte die Protein-Probe vorher ultrafiltriert werden.
Tabelle 32 Stammlösungen der untersuchten Peptide.
Peptid Konzentration
C1_3er 2.86 mg in 174.2 µL H2O. 50 mM C2_5er 2.70 mg in 98.8 µL H2O. 50 mM Peptid T4-8 2.77 mg in 92.7 µL H2O. 50 mM HM7er 2.89 mg in 79.6 µL H2O. 50 mM C4_6er 2.62 mg in 65.2 µL H2O. 50 mM Peptid T 2.31 mg in 53.9 µL H2O. 50 mM VIP5-12 3.08 mg in 60.0 µL H2O. 50 mM C2_10er 3.38 mg in 61.7 µL H2O. 50 mM C4_C1_10er 3.09 mg in 52.7 µL H2O. 50 mM VIP1-12 3.26 mg in 45.3 µL H2O. 50 mM
C2_10er_CHI 1.44 mg in 18.7 µL HBS-EP. 50 mM. Ausgefallen als weiße Flocken. Auf 10 mM verdünnt. Immer noch flockig. Auf 2 mM mit H2O verdünnt und 15 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Leicht trübe und flockig geblieben.
EXPERIMENTELLER TEIL
Die 50 mM Stammlösungen wurden mit HBS-EP-Puffer auf die erforderlichen Konzentrationen verdünnt. Die Peptidlösungen wurden auf 200 µM verdünnt und je 100 µL mit dem Befehl inject (I) injiziert.
Die Beschreibungen der BIACORE-Experimenten werden in Tabellenform erfolgen, da hieraus eine höhere Übersichtlichkeit resultiert.
Neuer Puffer HBS-EP, T= 25°C, Flow 5 µL/min, neuer Chip CM5 Aktivierung: 100 µL NHS/EDC 1200 s
Fc1: nichts
Fc2: 40 µL IgG (Anti-Myoglobin AB) (2 µg + 100 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 1620 RU
Fc3: 10 + 30 + 20 +10 µL CD4 (CHO, 7.2.2) (3 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 4115 RU Fc4: 10 µL CD4 (CHO, 7.2.2) (3 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 423 RU
Deaktivierung: 100 µL EA 1200 s
Peptide: 200 µM, C1_3er, C2_5er, Peptide T4-8, HM7er, C4_6er, Peptide T, VIP5-12, C2_10er, C4_C1_10er, VIP1-12, (4 µM): C2_10er_CHI
KI 40 µL 120 s Dissoziationszeit
gp120 (7.2.3) 1 µM, [15 µL (6.7 µM Stammlösung) + 85 µL HBS-EP-Puffer]
KI 40 µL 2000 s Dissoziationszeit Verdünnungsreihe:
gp120 (7.2.3): 1, 0.6, 0.3 und 0.1 µM in HBS-EP-Puffer KI 40 µL 240 s Dissoziationszeit
Regenerationspulse: QI 10 µL 100 mM HCl Flow: 35 µL/min
Der Chip war 15 Tage in HBS-EP-Puffer gelagert. Mit Wasser gründlich gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
Puffer: HBS-EP, T= 25°C, Flow 5 µL/min HCl 10 mM 3 · QI 5 µL
Puffer entgast
Puffer-Injektion: QI 20 µL
HCl 10 mM 2 · QI 5 µL , 1 · QI 1 µL 1 h Wartezeit, Basislinie ist stabil.
gp120 (7.2.3) 0.5 µM, [15 µL (15 µM Stammlösung) + 185 µL HBS-EP-Puffer]
KI 140 µL 3600 s Dissoziationszeit HCl 10 mM 4 · QI 5 µL
Puffer-Injektion: QI 50 µL Zweiter Chip.
Neuer Puffer HBS-EP, T= 25°C, Flow 5 µL/min, neuer Chip CM5 Aktivierung: 100 µL NHS/EDC 1200 s
Fc1: nichts
Fc2: QI 40 µL CD4 (CHO, 7.2.2) (2 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 6200 RU
Fc3: QI 40 µL CD4 (CHO, 7.2.2 zweiter Teil vom CD4 16.8.99 ultrafiltriert) (2 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 6000 RU
Fc4: 10 +20 µL CD4 (CHO, 7.2.2 zweiter Teil vom CD4 16.8.99 ultrafiltriert) (2 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 1500 RU
Deaktivierung: 100 µL EA 1200 s Verdünnungsreihe:
EXPERIMENTELLER TEIL
Peptid C4_C1_10er : 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 und 10 mM in HBS-EP-Puffer KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit
Regenerationspulse: QI 5 µL 10 mM HCl nach der 10 mM Injektion Puffer-Injektionen: QI 2 · 100µL HBS-EP
Puffer entgast, 5 Minuten Ultraschallbad.
Peptidlösungen:
VIP5-12 1.0 mM KI 40 µL 120 s Dissoziationszeit Lactose 10 mM KI 40 µL 120 s Dissoziationszeit Lactose 10 mM KI 40 µL 120 s Dissoziationszeit HM7er 0.5 mM KI 40 µL 120 s Dissoziationszeit HM7er 1.0 mM KI 40 µL 120 s Dissoziationszeit VIP1-12 1.0 mM KI 40 µL 120 s Dissoziationszeit Übernacht gespült mit 5 µL/min
NORMALIZE
gp120 100 nM KI 240 µL 2880 s Dissoziationszeit Peptidlösungen:
C1_3er 2.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2_5er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit HM7er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit PeptidT4-8 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit VIP5-12 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C4_C1_10er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit PeptideT 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C4_C1_10er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2/V5_13er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2_10er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2_1oerCHI 20 µM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit VIP5-12 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit gp120 100 nM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit Übernacht gespült mit 5 µL/min
C4_C1_10er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit VIP1-12 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit VIP1-12 2.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C1_3er 2.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2/V5_13er 2.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2_10erCHI 1.0 µM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit gp120 200 nM I 50 µL
C4_C1_10er 10 mM KI 50 µL 600 s Dissoziationszeit
Von den weiteren zu testenden Peptiden wurden Stammlösungen (50 mM) in Wasser angesetzt.
Tabelle 33 Stammlösungen der untersuchten Peptide.
Peptid Konzentration
V5_5er 1.60 mg in 64 µL H2O. 50 mM Rev_C3_7er 1.81 mg in 54 µL H2O. 50 mM C2_7er 0.3 mg in 7.2 µL H2O. 50 mM V5/C5_9er 1.72 mg in 36 µL H2O. 50 mM C2_10er_N 1.36 mg in 24 µL H2O. 50 mM
EXPERIMENTELLER TEIL
Der Chip war 3 Monate in HBS-EP-Puffer gelagert. Mit Wasser gründlich gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
PRIME
NORMALIZE
gp120 100 nM KI 40 µL 240 s Dissoziationszeit Peptidlösungen:
HM7er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit PeptidT4-8 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit Lactose 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit V5_5er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit Rev_C3_7er 1 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2_7er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit V5/C5_9er 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit C2_10er_NAc 1.0 mM KI 40 µL 480 s Dissoziationszeit Probleme mit der Referenzzelle. Chip wurde verworfen.
Von den zu testenden Peptiden wurden Stammlösungen (50 mM) in Wasser angesetzt.
Tabelle 34 Stammlösungen der untersuchten Peptide.
Peptid Konzentration
C4_C1_11er 2.1 mg in 32.7 µL H2O. 50 mM (nicht löslich) C4_C1_11er_I(-1)F 3.5 mg in 53 µL H2O. 50 mM (nicht löslich) C4_C1_10er_G7A 0.63 mg in 10.6 µL H2O. 50 mM
C4_C1_10er_G7P 1.46 mg in 24.1 µL H2O. 50 mM C4_C1_10er_V6I 0.92 mg in 15.5 µL H2O. 50 mM C4_C1_10er_K5R 1.45 mg in 24.2 µL H2O. 50 mM C4_C1_10er_Q4S 0.88 mg in 15.6 µL H2O. 50 mM C4_C1_10er_W3Y 0.76 mg in 13.2 µL H2O. 50 mM C4_C1_10er_M2S 1.66 mg in 29.4 µL H2O. 50 mM C4_C1_10er_N1E 0.32 mg in 5.4 µL H2O. 50 mM
Rev_C4_C1_10er 1.32 mg in 22.5 µL H2O. 50 mM (nicht löslich) Dritter Chip.
Neuer Puffer HBS-EP, T= 25°C, Flow 5 µL/min, neuer Chip CM5 NORMALIZE
Aktivierung: 100 µL NHS/EDC 1200 s Fc1: nichts
Fc2: QI 40 µL CD4 (CHO, 7.2.2) (2 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 4825 RU Fc2: QI 20 µL CD4 (CHO, 7.2.2) (2 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 876 RU Fc2: QI 30 µL CD4 (CHO, 7.2.2) (2 µg + 150 µL NaAc-Puffer pH: 4.5) 2633 RU Deaktivierung: 100 µL EA 1200 s
I 40 µL HBS-EP I 5 µL HBS-EP I 10 µL HBS-EP I 10 µL Wasser
I 10 µL H3PO4 (100 mM)
EXPERIMENTELLER TEIL
I 20 µL HBS-EP
I 20 µL HM7er 1 mM I 20 µL C4C1_10er 1 mM I 20 µL C4C1_10er 2 mM
Verdünnungsreihe (Negativ-Kontrolle):
Peptid HM7er : 2, 3, 5 und 10 mM in HBS-EP-Puffer I 20 µL
Übernacht gespült mit 5 µL/min Puffer entgast (10 min)
I 20 µL HBS-EP I 20 µL HBS-EP I 20 µL HBS-EP
C4_C1_11er 1.0 mM I 20 µL 100 RU auf der Fc1 geblieben !!!
Diverse Reinigungsschritte I 20 µL HBS-EP
Peptidlösungen:
Zwischen jedem Peptide KI 20 µL HBS-EP 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_G7A 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_G7P 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_V6I 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_K5R 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_Q4S 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_W3Y 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_M2S 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit C4_C1_10er_N1E 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit
Rev_C4_C1_10er 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit 300 RU auf der Fc3 geblieben Diverse Reinigungsschritte
C4_C1_10er 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit Positiv-Kontrolle C4_C1_10er_K5R 1.0 mM KI 20 µL 270 s Dissoziationszeit Positiv-Kontrolle Anschließend die Peptide von H. Möller vermessen.
Der Chip war 8 Tage in HBS-EP-Puffer gelagert. Mit Wasser gründlich gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
Puffer: HBS-EP, T= 25°C, Flow 5 µL/min Stark fallende Basislinie
HBS-EP QI 20 µL Wasser QI 20 µL Wasser QI 20 µL HBS-EP QI 20 µL
1 h Wartezeit, Basislinie ist stabil.
C4_C1_10er 1.0 mM I 20 µL Positiv-Kontrolle Konzentrationsreihe C4_C1_10er V-I
Konzentrationen: 50, 100, 300, 600 und 1000 µM, I 20 µL Konzentrationsreihe C4_C1_10er K-R
Konzentrationen: 50, 100, 300, 600 und 1000 µM, I 20 µL Konzentrationsreihe C4_C1_10er Q-S
Konzentrationen: 50, 100, 300, 600 und 1000 µM, I 20 µL Außerdem noch weitere Konzentrationsreihen für H. Möller.
EXPERIMENTELLER TEIL
7.7.4 Biacore-Bindungsstudien mit immobilisierten