BH3-Mimetika induzieren Zelltod unabhängig von Bax und Bak

Bislang haben wir gezeigt, dass Gossypol, HA4-1 und BH3I-2´ Apoptose unabhängig vom Bcl-x_L- bzw. Bcl-2-Expressionsstatus induzieren und somit die durch diese Proteine vermittelte Apoptoseresistenz überwinden können. Handelt es sich um echte BH3-Mimetika, so ist die Apoptoseinduktion abhängig von Bax und Bak. Um die Bax/Bak Abhängigkeit der drei BH3-Mimetika im Zusammenhang des intrinsischen Apoptosewegs untersuchen zu können, wurden HCT116 wt (HCT116 Bax+/Bak+) Zellen und HCT116 Bax ko/Bak kd (Bax-/Bak-) Zellen verwendet. HCT116 Bax+/Bak+ Zellen exprimierten sowohl Bax als auch Bak, wohingegen HCT116 Bax-/Bak- Zellen weder Bax noch Bak exprimierten (Abb. 11A). Unbehandelte Kolonkarzinomzellen wiesen nach 72 Stunden eine nur geringe Grundapoptose auf. Die Inkubation von HCT116 Zellen mit Gossypol führte zur Erhöhung der Apoptoserate. Nach einer Behandlung mit 50 µM Gossypol zeigten sowohl ca. 45 % der HCT116 Bax+/Bak+ Zellen als auch 50 % der HCT116 Bax-/Bak- Zellen fragmentierte DNA (Abb. 11B). Die Apoptoserate war somit unabhängig von Bax und Bak. Die durch 50 µM HA14-1-induzierte Apoptose lag in HCT116 Bax+/Bak+ und HCT116 Bax-/Bak- Zellen bei ca. 75 % (Abb. 11B). Auch die Behandlung von Kolonkarzinomzellen mit HA14-1 führte somit unabhängig vom Bax/Bak-Expressionsstatus zum Zelltod. Die Behandlung mit 30 µM BH3I-2´ resultierte in beiden Zelllinien in ca. 25 % apoptotischen Zellen. HCT116 Bax-/Bak- Zellen zeigten auch nach einer Behandlung mit 50 µM BH3I-2´ nur einen schwachen Anstieg der Apoptoserate, wohingegen diese in HCT116 Bax+/Bak+ Zellen verdoppelt war.

Abb. 11: BH3-Mimetika induzieren Zelltod in HCT116 Bax+/Bak+ und HCT116 Bax-/Bak- Zellen

A Westernblotanalyse von Bax und Bak in HCT116 Bax+/Bak+ und HCT116 Bax-/Bak- Zellen. Aktin diente als Ladekontrolle.

B Dargestellt ist die dosisabhängige Induktion von hypodiploiden Zellen in % nach Behandlung mit 30 bzw. 50 µM Gossypol, HA14-1 bzw. BH3I-2´. HCT116 Bax+/Bak+ (weiße Kreise) und HCT116 Bax-/Bak- (schwarze Kreise) Zellen wurden 72 Stunden in Anwesenheit der BH3-Mimetika inkubiert und anschließend die Apoptoserate durchflusszytometrisch bestimmt.

Die Versuche wurden dreimal durchgeführt. Jeweils ein Beispiel ist mit Mittelwert von drei Messwerten +/- Standardabweichung gezeigt.

In Übereinstimmung mit den vorherigen Ergebnissen, scheint der Wirkmechanismus von BH3I-2´ somit zum Teil vom Bcl-2 Signalweg abzuhängen also von Bax, Bak, Bcl-x_L und Bcl-2. Im Gegensatz dazu wirken Gossypol und HA14-1 völlig unabhängig von Bax, Bak, Bcl-x_L und Bcl-2.

5.1.3.1 BH3-Mimetika induzieren den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials

Die bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass die Bcl-2 Inhibitoren Gossypol, HA14-1 und BH3I-2´ (zum Teil) DNA-Fragmentierung in Kolonkarzinomzellen unabhängig von Bax und Bak auslösen. Um die Rolle des intrinsischen Apoptosewegs zu untersuchen, wurde der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, ein charakteristisches Kennzeichen der mitochondrialen Apoptose, analysiert. Die Änderung des mitochondrialen Membranpotentials wurde mit dem kationischen, potentialabhängigen, sich in Mitochondrien anreichernden Fluorochrom JC-1 analysiert. Apoptosesignale bewirken die Herabsetzung des Membranpotentials, d.h. es lassen sich bei der Messung vermehrt Zellen mit verminderter Fluoreszenz nachweisen. Die JC-1 Fluoreszenzintensität wurde durchflusszytometrisch auf Einzelzellniveau gemessen. Der prozentuale Anteil von Zellen mit verminderter Fluoreszenz wurde für die quantitative Auswertung verwendet. Nach Behandlung mit 30 µM Gossypol zeigten im Vergleich zu unbehandelten Zellen rund 65 % der HCT116 Bax+/Bak+ Zellen und auch 65

% der HCT116 Bax-/Bak- Zellen ein reduziertes mitochondriales Membranpotential (Abb. 12). Die Behandlung mit HA14-1 führte ebenfalls im Vergleich zu Kontrollzellen in 75 % der HCT116 Bax+/Bak+ Zellen und auch in 80 % der HCT116 Bax-/Bak- Zellen zur Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials (Abb. 12). Im Gegensatz zu HCT116 Bax+/Bak+ Zellen wo ca. 50 % der Zellen ein reduziertes Mitochondrienmembran-potential aufwiesen, zeigten nur 25 % der HCT116 Bax-/Bak- Zellen ein reduziertes MembranMitochondrienmembran-potential nach BH3I-2´-Behandlung (Abb. 12). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die putativen BH3-Mimetika Gossypol, HA14-1 und BH3I-2´ unabhängig von Bax und Bak die Mitochondrien aktivieren, wobei dies nur zum geringen Teil auf BH3I-2´ zutrifft.

Abb. 12: BH3-Mimetika induzieren den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials HCT116 Bax+/Bak+ (weiße Balken) und HCT116 Bax-/Bak- (schwarze Balken) Zellen wurden mit 30 µM Gossypol, HA14-1 bzw. BH3I-2´ behandelt und nach 48 Stunden mit dem Fluoreszenzfarbstoff JC-1 gefärbt, der abhängig vom Membranpotential in den Mitochondrien akkumuliert. Dargestellt sind Zellen mit reduzierter Fluoreszenzintensität in %, welche durchflusszytometrisch erfasst wurden.

Die Versuche wurden dreimal durchgeführt. Jeweils ein Beispiel ist mit Mittelwert von drei Messwerten +/- Standardabweichung gezeigt.

5.1.3.2 Caspasen werden durch BH3-Mimetika aktiviert

Gossypol, HA14-1 und zum Teil auch BH3I-2´ induzierten DNA-Fragmentierung und den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials unabhängig von Bax und Bak. DNA-Fragmentierung und die Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials gelten als Kennzeichen der Apoptose. Um die These der von Bax und Bak unabhängigen Apoptose stützen zu können, wurden die verwendeten BH3-Mimetika auf die Fähigkeit der Caspaseaktivierung untersucht. FAM-VAD-FMK bzw. FAM-DEVD-FMK sind fluoreszenzmarkierte Substrat-inhibitoren der Caspaseaktivität, welche kovalent an einen Cysteinrest der großen aktiven Caspaseuntereinheit binden. FAM-VAD-FMK bindet an Caspase-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 und -9 und inhibiert somit nahezu alle Caspasen, wohingegen FAM-DEVD-FMK nur an die Caspasen-3 und -7 bindet. Ungebundene Inhibitoren werden aus den Zellen ausgewaschen. Die Behandlung mit Gossypol bzw. HA14-1 resultierte im Vergleich zu unbehandelten Zellen sowohl in HCT116 Bax+/Bak+ als auch in HCT116 Bax-/Bak- Zellen in der Aktivierung von Caspasen (Abb. 13A). Ca. 75 % der HCT116 Bax+/Bak+ und auch der HCT116 Bax-/Bak- Zellen zeigten nach einer Inkubation mit 30 µM Gossypol Caspaseaktivität. Die 48-stündige Inkubation mit 30 µM HA14-1 führte zu ca. 55 % caspaseaktivierten HCT116 Bax+/Bak+ und HCT116 Bax-/Bak- Zellen. Zur genaueren Charakterisierung der Caspaseaktivierung wurde weiterhin die Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 überprüft. So induzierte Gossypol im Vergleich zu Kontrollzellen in ca. 70 % der HCT116 Bax+/Bak+ aber auch in 75 % der HCT116 Bax-/Bak- Zellen Caspase-3/-7 Aktivierung (Abb. 13B). Auch die Behandlung mit 50 µM HA14-1 führte nach 48-stündiger Behandlung sowohl in ca. 60 % der HCT116 Bax+/Bak+ Zellen als auch in 75

% der HCT116 Bax-/Bak- Zellen zu aktivierten Effektorcaspasen. Die Behandlung von HCT116 Bax-/Bak- Zellen mit 50 µM BH3I-2´ resultierte in ca. 25 % der Zellen in Pancaspaseaktivität, wohingegen ca. 55 % der HCT116 Bax+/Bak+ Zellen Caspaseaktivität zeigten (Abb. 13A). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Pancaspaseaktivität nach BH3I-2´ Behandlung zeigten auch nur 25 % der HCT116 Bax-/Bak- Zellen Effektorcaspase-Aktivität im Vergleich zu HCT116 Bax+/Bak+ Zellen (Abb. 13B).

Zusammenfassend kann man festhalten, dass neben der DNA-Fragmentierung und dem Verlust des mito-chondrialen Membranpotentials auch die Aktivierung von Caspasen im Zuge des durch Gossypol bzw. HA14-1 induzierten, Bax und Bak unabhängigen Zelltods beobachtet wurde. BH3I-2´ induzierte Caspaseaktivität hingegen weitgehend Bax/Bak-abhängig.

Abb. 13: BH3-Mimetika aktivieren Caspasen

HCT116 Bax+/Bak+ (weiße Kreise) und HCT116 Bax-/Bak- (schwarze Kreise) Zellen wurden 48 Stunden nach der Behandlung mit Gossypol, HA14-1 bzw. BH3I-2´ mit fluoreszenzmarkierten, irreversibel bindenden Substratinhibitoren der Caspaseaktivität inkubiert. Zellen mit aktivierten Caspasen fluoreszieren und werden durchflusszytometrisch erfasst.

A Dargestellt sind FAM-VAD-FMK positive Zellen in %, welche Pancaspase-aktivierten Zellen entsprechen.

B FAM-DEVD-FMK positive Zellen sind in % dargestellt. Dies entspricht Caspase-3/-7-aktivierten Zellen.

Die Versuche wurden dreimal durchgeführt. Jeweils ein Beispiel ist mit Mittelwert von drei Messwerten +/- Standardabweichung gezeigt.