Bestimmung spenderreaktiver Zellen in PBMZ
Die Bestimmung spenderreaktiver Zellen in PBMZ stellte insofern eine interessante Aufgabe dar, als dass PBMZ in relativ großer Menge (etwa eine Million Zellen/ml venöses Blut) in kurzen Zeitabständen ohne Risiko einer Schädigung des Transplantats mit der im Vergleich zur Nierenbiopsie „noninvasiven“ Technik der peripheren Punktion einer Vene gewonnen werden können, wobei für den Patienten nur geringstmögliche Unannehmlichkeiten bestehen. Damit existieren ideale Voraussetzungen für ein immunologisches Monitoring, welches zu jedem gewünschten Zeitpunkt Auskunft über die jeweilige Immunaktivierung gegen das Transplantat geben könnte.
Heeger et al. hatten zwar über einen Zusammenhang zwischen spenderreaktiven Gedächtniszellen im Blut vor Transplantation und dem Auftreten von akuten Rejektionen berichtet [95], es stellte sich jedoch die Frage, ob sich dies in einer anderen Patientengruppe
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reproduzieren lässt und ob sich der Blutkreislauf auch nach Transplantation als geeignetes Kompartiment zur Messung spenderreaktiver Zellen erweist oder ob die jetzt zu betrachtenden schon geprimten und aktivierten Effektor-T-Zellen durch im Gegensatz zu naiven T-Zellen vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen (LFA1, VLA4) oder Chemokinrezeptoren (CCR1, CCR2, CCR5, CXC Chemokinrezeptor) [97] nicht viel eher im Transplantat akkumulieren, während sie im Blut eine Frequenz unterhalb der Nachweisgrenze aufweisen.
Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass spenderreaktive, IFNγ-produzierende Zellen auch nach Transplantation und unter Immunsuppression im ELISpot-Assay nachweisbar sind.
Zusätzlich konnte für einige Patienten kurz vor oder während einer akuten Rejektion des Transplantats ein Anstieg der spenderreaktiven Zellen beobachtet werden und ein generell erhöhtes Niveau war mit einer eingeschränkten Nierenfunktion ein Jahr post-Tx assoziiert. Die Messung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen in PBMZ mittels des ELISpot-Assays erscheint diesbezüglich als zukünftige Methode des Immunmonitoring nierentransplantierter Patienten geeignet.
Stellenwert des ELISpot-Assays
Das ELISpot-Assay wird vielseitig unter anderem für das Monitoring antigenspezifischer Immunantworten im Kontext der Vakzinenentwicklung, Krebs- und Autoimmunitätsforschung verwendet [98, 99, 100]. Der im Gegensatz zum LDA-Verfahren relativ geringe Arbeitsaufwand und die vom jeweils zu bestimmenden Zytokin abhängende kurze Dauer des Assays bieten zusammen mit der hohen Sensitivität mit einer Detektionsschwelle von weniger 1/106 Zellen unübersehbare Vorteile, die vor allem für das routinemäßige Immunmonitoring transplantierter Patienten von Bedeutung sein könnten. Demgegenüber stehen allerdings nicht zu vernachlässigende Einschränkungen: Im Gegensatz zu durchflusszytometrischen Messungen z.B., können mit dem ELISpot-Assay keine Aussagen über den Phänotyp der untersuchten Zellen, deren Subpopulationen und weiteren Funktionen getroffen werden, da in einem Ansatz neben dem gemessenen Zytokin keine weiteren Zytokine oder Oberflächenmarker erfasst werden können.
Obwohl in einigen Studien eine Korrelation zwischen der Anzahl der Zellen gemessen im ELISpot-Assay und der von Vorläuferzellen gemessen mittels LDA anhand mehrerer Effektorfunktion gefunden wurde[101], so ließ die Reproduzierbarkeit des in dieser Arbeit verwendeten Verfahrens zu wünschen übrig. Während die Messung antigenspezifischer T-Zellen (CMV) zwischen einzelnen Wells bei hohen T-Zell-Antworten durchschnittlich einen
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Variationskoeffizienten von 8 %, bei niedrigen 21 % ergab, so variierten die Antworten auf verschiedenen 96-Well-Platten bei hohen Antworten um 25 %, bei niedrigen um 42 %. Das aber bedeutet einen Unterschied zwischen zwei theoretisch gleichen Ansätzen von mehr als 100 % ! Bei der Messung alloreaktiver T-Zellen betrug der Variationskoeffizient innerhalb der einzelnen Wells zwischen 28 % und 13 %. Bei einem niedrigen Cut-Off von 10 bzw. 40 Spots, wie er sich hier für die Messung spenderreaktiver, IFNγ-produzierender Zellen für Woche zwei und drei bzw. dem maximalen Wert post-Tx als günstig erwies, wäre das von entscheidender Bedeutung.
Die Arbeitsgruppe um Heeger et al., die das Assay ebenfalls auf Reproduzierbarkeit getestet hat, kommt auf ähnliche Ergebnisse [102]. In einer von ihnen durchgeführten Analyse der Reproduzierbarkeit alloreaktiver T-Zell-Antworten in Nierentransplantierten mit stabiler Nierenfunktion wurden Abweichungen zwischen den Messwerten verschiedener Untersucher von bis zu 27 % beobachtet. Da der Fehler einer Messung durch genügend Ansätze in den Hintergrund tritt, hat die Verbesserung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Vorrang.
Ein weiterer Nachteil des ELISpot-Assays besteht in der fehlenden Vergleichbarkeit der Werte zwischen verschiedenen Laboren. Trotz computergestützter Analyse herrscht ein großes Maß an Subjektivität bezüglich der Interpretation der Spotanzahl, da die vielen vom Benutzer gewählten Analysebedingungen wie Empfindlichkeit, Helligkeit, Gradient, Kontrast, Spottrennbarkeit und Spotgröße nicht standardisiert sind.
Versuch der Optimierung des Assays
Einfluss von Bestrahlung mit 30 Gray
Die Bestrahlung von Stimulatorzellen hat sich im MLR-Verfahren hinsichtlich verlässlicher Proliferationsinhibition bewährt. Trotzdem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass sie auch einen hemmenden Einfluss auf die IFNγ-Sekretion durch PBMZ besitzt, so war dieser doch zu gering um sicher zu sein, dass die im ELISpot-Assay gemessene Zytokinsekretion ausschließlich von Responderzellen stammt. Dies ist jedoch wichtig, da bei der Nierentransplantation vorrangig die Immunantwort des Transplantatempfängers gegen das Transplantat von Interesse ist. Weiterhin fiel eine erhöhte spontane Produktion von IFNγ durch unstimulierte, bestrahlte Zellen auf. Diese wurde ebenfalls von Heeger et al. [1] beschrieben und von Galdiero et al. als dosisabhängiger Effekt der γ-Bestrahlung auf die Zytokinproduktion von Lymphozyten charakterisiert [103]. Durch die Erhöhung der Leerwerte nach Bestrahlung kam es teilweise zu negativen Werten spenderspezifischer T-Zellfrequenzen, was einen
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weiteren Nachteil der Bestrahlung von Stimulatorzellen bedeutet, die deshalb in keinem weiteren ELISpot-Assay dieser Art mehr Anwendung finden sollte.
Zelldepletion
Da nach theoretischen Überlegungen vor allem T- und NK-Zellen für eine IFNγ-Sekretion der Stimulatorzellen verantwortlich sind, konnte in dieser Arbeit durch Depletion CD2pos T- und NK-Zellen mit Hilfe magnetischer Antikörper eine Stimulatorzellpopulation generiert werden, die in Folgeuntersuchungen tatsächlich weder auf Antigenstimulation mit PHA noch auf Alloantigenstimulation eine IFNγ -Produktion zeigte. Somit ist davon auszugehen, dass nach Stimulation mit derartig generierten Spenderzellen jeder IFNγ-Spot im ELISpot-Assay von einer Responderzelle stammte.