3.6 Aufnahme und Beurteilung der Präparate
3.6.2 Beurteilungsdefinitionen
Als Primordialfollikel wurden Follikel ohne erkennbare Granulosazellen ausgezählt. Follikel, die mehr als zwei cuboide Granulosazellen um sich hatten, wurden als Primärfollikel gezählt.
Als Sekundärfollikel I wurden Follikel mit mehr als einer Granulosareihe ohne erkennbare Thekazellschicht, als Sekundärfollikel II Follikel mit mehr als einer Granulosareihe und erkennbarer Thekazellschicht ohne Antrum gezählt. Tertiärfollikel und Graafsche Follikel wurden zusammengefasst als Follikel mit erkennbarem Antrum und erkennbarer Thekazellschicht. Die Größe der Tertiär- und Graafschen Follikel wurde nicht vermessen, da auf den drei ausgezählten Schnitten nicht garantiert werden konnte, dass diese in der Mitte getroffen wurden.
Die Thekazellschichten der Sekundärfollikel II, der Tertiär- und Graafschen Follikel wurden auf ihre Form beurteilt und unterteilt in Schichten mit flachen oder runden Thekazellen. Bei der Betrachtung zeigte sich, dass die Ovarien deutliche Unterschiede in den Reservoirs an Primordialfollikeln hatten. Ebenfalls fiel auf, dass bei vielen Ovarien Corpora lutea (CL) und/oder Zellverbänden in Form von Corpora lutea ohne die von Fraser (Young et al. 1997) beschriebenen Lutealzellen (von uns als kleinzelliges Lutealgewebe bezeichnet) vorlagen.
Außerdem zeigte sich bei vielen Ovarien durchlöchertes Stroma, sowie atretische Follikel jeden Stadiums. Als atretisch wurden Follikel definiert, deren Granulosazellen keinen Gewebeverband mehr darstellten. Die kleinen Überbleibsel, meist in der Region des durchlöcherten Stromas angesiedelt, wurden durch eine Zona-pellucida-3- Färbung (ZP3) als Oozytenrest verifiziert und daraufhin ausgezählt.
3. Material und Methoden 16
3.7 Immunhistologische Färbungen
3.7.1 Immunhistologische ZP3-Färbung
ZP3, als Bestandteil der Zona pellucida von Eizellen, wurde in einer immunhistologischen Färbung nachgewiesen, um die Eihüllenreste im Stroma nachzuweisen. Dafür wurden die Schnitte zunächst in Xylol entparaffiniert, in absteigender Ethanolreihe (je 2 mal 5 min 100 %, 90 %, 75 %, 50 %) rehydriert und in H2O destilliert gewaschen. Dann wurden die Schnitte dreimal für 5 min in der Mikrowelle bei 600 Watt erhitzt und auf RT abkühlen gelassen. Pro Schnitt wurden 50 µl Serum-Blockierungslösung aus Histostain® Bulk Kit für den primären Antikörper Kaninchen für 10 min aufgebracht. Danach wurde der Schnitt mit dem primären Antikörper ZP3 (Kaninchen-anti Mensch, Santa Cruz Biotechnology) 1:500 verdünnt in PBS aufgebracht und über Nacht bei 4°C inkubiert. Es folgten dreimaliges Waschen für 5 min in PBS, Inkubation für 60 min mit dem sekundären Antikörper (aus dem Histostain® Bulk Kit für den primären Antikörper Kaninchen),10 min Inkubation mit Enzym Konjugat (aus dem Histostain® Bulk Kit für den primären Antikörper Kaninchen), wieder dreimaliges Waschen für 5 min in PBS, dann Visualisierung mit AEC-Kit (DAKO) für 20 min und zweimaliges Waschen in H2O bidestilliert für 5 min. Die Gegenfärbung erfolgte mit Hämalaunlösung (Mayers) 1:10 in PBS verdünnt für 5 min. Anschließend wurden die Schnitte je 5 min dehydriert in aufsteigender Ethanolreihe (50 %, 75 %, 90 %, 100 %), für je 5 min zweimal in Xylol gegeben und daraus mit DePeX mounting medium (Gurr®) eingedeckt. ZP3 diente als Nachweis für Reste der Zona pellucida - Teil der Oozytenhülle.
3.7.2 Immunofluoreszenzdoppelfärbung ZP3/ Ki67
Zona pellucida 3 und Ki67, ZP3 als Eizellhüllenbestandteil und Ki67 als Marker für Proliferation, wurden in einer Immunofluoreszenzdoppelfärbung nachgewiesen, um nach proliferierenden Granulosazellen in den verschiedenen Follikelphasen zu sehen. Dazu wurden die Schnitte zunächst in Xylol entparaffiniert, dann in absteigender Ethanolreihe (je zweimal 5 min 100 %, 90 %, 75 %, 50 %) rehydriert und in H2O destilliert gewaschen. Dann wurden die Schnitte dreimal für 5 min in der Mikrowelle bei 600 Watt erhitzt, auf RT abkühlen gelassen und 50 µl/Schnitt Serum-Blockierungssolution aus Histostain® Bulk Kit für den primären Antikörper Kaninchen für 10 min aufgetragen. Es folgte die Versetzung der Schnitte mit dem primären Antikörper ZP3 (Kaninchen-anti Mensch, Santa Cruz Biotechnology) 1:500 verdünnt in PBS und Ki67 (Maus-anti Mensch, NovocastraTM) 1:100 verdünnt in PBS mit Inkubation bei 4°C über Nacht. Die Schnitte wurden dreimal 5 min in PBS gewaschen und mit den sekundären Antikörpern (S11 Ziege - anti Kaninchen, Alexa Fluor 488 (grün)
FCS) für 30 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Darauf wurden sie dreimal 5 min in PBS gewaschen (im Dunkeln), eingedeckt mit Fluormount (DAKO) und in lichtdichten Kästen bei 4°C gelagert.
3.7.3 Doppelmarkierung im Ventana Nexes (MHC-II/CD3)
MHC-II als Rezeptor auf den antigenpräsentierenden Zellen wie Makrophagen und CD3 als Teil des T-Zellrezeptorkomplexes wurden nachgewiesen, um die entzündliche Aktivität im Ovar beurteilen zu können. Die Schnitte wurden entparaffiniert und in H2O bidestilliert überführt. Die Antigendemaskierung wurde im Dampfkochtopf für 1 min mit 0,01 molarem Citratpuffer (pH = 6,0) durchgeführt und anschließend ca. 20 min im offenen Dampfkochtopf abkühlen gelassen. Die Schnitte wurden in H2O bidestilliert überführt und anschließend im Ventana Nexes nach folgendem Protokoll behandelt: 1.) für ersten Antikörper (MHC-II Dako Code M0775) 10 min Inkubation mit Ziegenserum zur Blockade unspezifischer Bindungsstellen; Titration des Primärantikörpers in 1:500 Verdünnung über 32 min;
Detektion mit Ventana Enhanced Alkaline Phosphatase Red Detection Kit; 2.) für zweiten Antikörper (CD-3 T-Zell Dako Code N1580) Titration für 32 min mit der Ready-to-use Lösung des Antikörpers; Fixation 2 min mit Glutaraldehyd; Detektion mit Ventana iVIEW DAB Detection Kit; Gegenfärbung für 4 min mit Hämatoxylin; Bläuen für 4 min mit Blueing-Reagent. Anschließend wurden die Schnitte nach aufsteigender Alkohlreihe eingedeckt.
3.8 Blutkollektion
Für die Messungen wurden Blutproben aus der follikulären Phase (Progesteron < 10 ng/ml) und Blutproben aus der Lutealphase (Progesteron > 48 ng/ml) verwendet. Die Kollektion der Blutproben erfolgte routinemäßig zur Zykluskontrolle. Dazu wurden jeweils 200 µl Blut aus der Vena femoralis entnommen, mit Heparin versetzt und ein Teil des Serums der Progesteronmessung zugeführt. Der Rest des Serums wurde bei - 80°C bis zu den weiteren Messungen gelagert. Zu den Messungen wurden Blutproben möglichst des Todestages oder in zeitlicher Nähe zur Ovarektomie verwandt.
3.9 Hormonmessungen
3.9.1 Progesteronbestimmung
Das Serumprogesteron wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassays gemessen. In IgG-beschichtete Plattenvertiefungen wurden nach 4-maligem Spülen mit Waschpuffer (PBS,
3. Material und Methoden 18 pH = 7,2) je 50 µl spezifischer Antikörper (1:25000 in BSA-Puffer verdünnt, pH = 7,5), 50 µl Progesteronenzymlabel (1:250 in BSA-Puffer verdünnt, pH = 7,5) und 50 µl Serum (1:30 verdünnt in BSA-Puffer, pH = 7,5) bzw. den Standardproben (50 µl, 2,5-250 pg pro Vertiefung) gegeben. Die anschließende Inkubation bei 4°C lief über 18 h. Im Anschluss erfolgte wiederum Spülung mit Waschpuffer und Zugabe von 150 µl Streptavidin-Peroxidase (2000 ng/20 µl verdünnt in 16 ml BSA-Puffer). Nach einstündiger Inkubation auf dem Schüttler bei RT im Dunkeln erfolgte Zugabe von Stopppuffer (50 µl 2M H2SO4) mit anschließender Absorptionsmessung bei 450 nm auf einem Plattenleser. Parallele Messkurven wurden anhand von Progesteronstandards und -kontrollen durchgeführt. Qualitätskontrollen fanden mit jeder Messung statt.
3.9.2 Gesamtöstrogenmessung
Das immunoreaktive Gesamtöstrogen wurde ermittelt, indem es mit einem Antiserum gegen 1,3,5(10)-Östratrien-3,17β-Diol-17HS-BSA (Meyer et al. 1997) und Östradiol-17β gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase (HRP) als Enzymkonjugat.versetzt wurde, das in Kaninchen erzeugt wurde. Die Serumproben wurden 1:5 in Puffer (0,04 M PBS, pH = 7,2) verdünnt und je 50 µl in Doppelbestimmung eingesetzt. Die zu überprüfenden Proben und die Estradiol-17β Standardproben (50 µl, 1.9-250 pg pro Vertiefung) wurden zusammen mit Estradiol-HRP-Enzymkonjugat (50 µl, 1:5000) und Antiserum (50 µl, 1:60000) über Nacht bei 4°C inkubiert.
Nach der Inkubation und dem Waschen der Platten wurde jede Vertiefung mit 150 µl HRP-Substratlösung (3125 mg Tetramethylbenzidin in 250 µl Dimethyl-Sulfoxid (DMSO)) gelöst in 17 ml Substratpuffer (0,05 M Zitronensäure mit 0,055 M Na2HPO4 und 0,005 M Hydrogen-Peroxid-Harnsäure) bestückt und anschließend die Platten im Dunklen bei RT für 60-90 min auf einem Schüttler inkubiert. Die Enzymreaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 50 µl 2 M H2SO4in jede Vertiefung und die Absorption wurde bei 450 nm auf einem Plattenleser gemessen. Die Sensitivität der Probendurchführung bei 90 %iger Bindung lag bei 1,5 pg. Anhand der Östrogen-Standards und Östrogen-Kontrollen wurden parallele Messkurven erstellt. Die Faktoren der Abweichung innerhalb der Probendurchführung, bemessen durch wiederholte Bestimmungen der hohen und tiefen Werte der Qualitätskontrolle, waren 18,97 % (tief - n = 12) und 5,39 % (hoch - n = 12).
3.9.3 Androstendionbestimmung
Androstendion im Serum wurde durch den Enzymimmunassay DSL-10-3800 Active® Kit ermittelt. In mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Gammaglobulin-Serum beschichteten Mikrotiterplatten wurden die Seren 1:40 verdünnt in PBS (je 25 µl) und 100 µl
BSA) und 100 µl Androstendion-Antiserum (in BSA) eingebracht. Anschließend wurden die Platten für 1 h bei RT auf einem Schüttler inkubiert und dann 5-malig mit Mikrotiterplattenwaschlösung gewaschen. In jede Vertiefung wurden 100 µl TMB-Chromogen-Lösung (Tetramethylbenzidin in Zitratpuffer mit Wasserstoffperoxid) gegeben und weitere 15 min auf einem Schüttler inkubiert. 100 µl Stopplösung (0,2 M H2SO4) wurde zugegeben und die Absorption bei 450 nm auf einem Plattenleser gemessen. Die Messungen wurden in Doppelbestimmung durchgeführt und anhand der Androstendion-Standards und Androstendion-Kontrollen wurden parallele Messkurven erstellt. Die Faktoren der Abweichung innerhalb der Probendurchführung, bemessen durch wiederholte Bestimmungen der hohen und tiefen Werte der Qualitätskontrollen, waren 0 % (tief - n = 4) und 4,62 % (hoch - n = 4)
3.10 Weitere Serummessungen
3.10.1 Triglyzeridbestimmung
Triglyzeridwerte zur Blutfettbestimmung als Indikator für den Fettmetabolismus wurden mit dem Roche MODULAR System am Gerät ACN 781 bei Standardbedingungen bestimmt. Die Proben wurden 1:2 verdünnt mit PBS eingesetzt.
3.11 Glukosetoleranztest
Der Glukosetoleranztest wurde als Indikator für eine Glukosestoffwechselstörung der Tiere eingesetzt. Die Tiere wurden dafür über Nacht nüchtern gelassen; zunächst erfolgte eine Blutzuckermessung nüchtern mit handelsüblichem Blutzuckermessgerät (für alle Messungen das gleiche). Dann wurde den Tieren je 2 g Glukose / kg KG in Lösung verabreicht.
Daraufhin erfolgten alle 20 min weitere Blutzuckermessungen aus Kapillarblut bis 120 min nach Glukoseverabreichung.
3.12 Trijodthyronin/Tetrajodthyroninbestimmung
Freies Trijodthyronin und freies Tetrajodthyronin wurden mit dem Modular Analytics E170 System bestimmt. Zunächst wurden 15 µl Probe und ein Ruthenium-Komplex markierter T3/T4-spezifischer Antikörper inkubiert. Nach Zugabe von biotinyliertem T3/T4 und Streptavidin-beschichteten Mikropartikeln erfolgte die Zugabe von Antikörper-Hapten-Komplex. Es folgte eine weitere Inkubation. Dann wurde das Reaktionsgemisch in die
3. Material und Methoden 20 Messzelle überführt, wo Mikropartikel durch magnetische Wirkung auf der Oberfläche der Elektrode fixiert wurden. Danach wurden mit ProCell ungebundene Substanzen entfernt. Mit dem Photomultiplier wurden die Chemilumineszenzemissionen gemessen. Mittels gerätespezifischer Kalibrationskurve wurden die Ergebnisse vermittelt.
3.13 Statistische Methoden und graphische Darstellung
Der Zusammenhang zwischen den einzelnen Messgrößen wurde in Scatterplots dargestellt und weiterhin mit Pearson’s Korrelationskoeffizient r quantifiziert. r kann Werte von -1 (negative Korrelation) bis +1 (positive Korrelation) annehmen. Werte nahe bei 0 sprechen für keine Korrelation. Zusätzlich wurde ein entsprechender Signifikanztest durchgeführt, der prüft, ob die Korrelation signifikant von 0 verschieden ist. P-Werte kleiner als 0.05 wurden hierbei als signifikant bewertet.
Zur Darstellung wurden des Weiteren Boxplots und Balkendiagramme verwendet. Als deskriptive Werte wurden Minimum, Maximum, Median, Standardabweichung, sowie erstes (Q1) (25%) und drittes (Q2) (75%) Quartil angegeben.
CL-Gewebe, Quotient Primordial-/Primärfollikel, atretische Follikel, Gewicht, Taillenumfang und Triglyzeride der Studiengruppen 1 und 4 wurden paarweise mit dem Mann-Whitney-U verglichen. Auch hier galten p-Wert < 0.05 als signifikant. Alle statistischen Analysen wurden mit Statistica (Version 8, StatSoft) durchgeführt.
4 Ergebnisse
4.1 Einteilungsgrundlage
Auf den Schnitten der in der follikulären Phase entnommenen Ovarien zeigte sich eine unterschiedlich ausgeprägte Menge an luteinisiertem Gewebe als offensichtlichstes Unterscheidungsmerkmal. Da in der Follikelphase diese Strukturen nicht zu erwarten waren, wurde die Einteilung anhand dieser Strukturen vorgenommen. Des Weiteren erfolgte eine Unterteilung in vier Gruppen. CL-Gewebe mit vorwiegend großen Lutealzellen sind als großzelliges Lutealgewebe beschrieben, CL-Gewebe mit ausschließlich kleinen Zellen als kleinzelliges Lutealgewebe. Die Gruppen waren folgende: Gruppe 1 (G1) enthielt Ovarien mit großzelligem CL- und keinem kleinzelligen Lutealgewebe (n = 15); Gruppe 2 (G2) enthielt Ovarien mit großzelligem CL- und kleinzelligem Lutealgewebe (n = 12); Gruppe 3 (G3) enthielt Ovarien mit keinem CL- aber kleinzelligem Lutealgewebe (n = 15); Gruppe 4 (G4) enthielt Ovarien ohne Lutealstrukturen (n = 6), soweit dies auf den drei mindestens 50µm von einander entfernten Schnitten erkennbar war. Da die Gruppeneinteilung qualitativ erfolgte, gab es innerhalb der Gruppen deutliche Variationen in der Quantität.
Tabelle 1: Verteilung der Gewebetypen innerhalb der jeweiligen Gruppen
Gruppe
G2 Großzelliges und kleinzelliges
G3 Nur kleinzelliges
CL-Gewebe 0/ 0/ 0 2,43/ 0,54/
Die Progesteronmesswerte bei Entnahme lagen zwischen 1,5 ng/ml und 9,8 ng/ml mit einem Median von 2,15 ng/ml (Q1 = 1,15; Q2 = 4,3).
4. Ergebnisse 22
Abbildung 1: Beispiel Gruppe 1 einer HE-Färbung als Basis für grundlegende Beurteilungen -
Ausschnitt auf nächster Seite
Schnittgröße G1 im Median: 17,25 mm² (Q1 = 9,95;
Q2 = 26,12)
Abbildung 2: Beispiel Gruppe 2 einer HE-Färbung als Basis für grundlegende Beurteilungen -
Ausschnitt auf nächster Seite
Schnittgröße G2 im Median: 14,26 mm² (Q1 = 11,64; Q2 = 17,46)
Abbildung 3: Beispiel Gruppe 3 einer HE-Färbung als Basis für grundlegende Beurteilungen
Schnittgröße G3 im Median: 14,64 mm² (Q1 = 10,26;
Q2 = 17,63)
Abbildung 4: Beispiel Gruppe 4 einer HE-Färbung als Basis für grundlegende Beurteilungen
Schnittgröße G4 im Median: 10,32 mm² (Q1 = 6,52; Q2 = 15,74)
Großzelliges Lutealgewebe
Abbildung 5: Ausschnitt aus Beispiel G1: großzelliges CL-Gewebe
Kleinzelliges Lutealgewebe
Gemischtes Lutealgewebe
Abbildung 6: Ausschnitt aus Beispiel G2: kleinzelliges CL-Gewbe
4. Ergebnisse 24 Nicht nur die einzelnen CL-Gewebeanteile veränderten sich über die Gruppen - auch die Menge des Gesamt-CL-Gewebes nahm über die Gruppen von G1 zu G4 signifikant ab (M-W-U-Test G1 zu G4 p < 0,001). Auch die in G2 summierten Flächen von großzelligem und kleinzelligem CL-Gewebe waren niedriger als in G1.
4.2 Follikelanzahl und -beschaffenheit im Zusammenhang mit CL-Menge und Aktivität
Zunächst werden nun CL-Zusammenhänge auf Ovarbasis beleuchtet - später auch Zusammenhänge bezogen auf die Tiere in der Gesamtheit.
4.2.1 Primordialfollikel
Im Median (Q1/ Q2) (G1 = 42 (29,33/ 54,33); G2 = 55,83 (34,83/ 77,67); G3 = 71,33 (28/ 152,33); G4 = 143,17 (61/ 151,67)) war zu erkennen, dass in Gruppen mit großzelligem CL-Gewebe der Median der Anzahl an Primordialfollikeln niedriger war als in der Gruppe mit nur kleinzelligem CL-Gewebe. Sobald kein CL-Gewebe vorlag, war die Anzahl an Primordialfollikeln noch deutlich größer. Das Minimum lag in allen Gruppen auf nahezu gleich niedrigem Niveau, die Maxima waren ansteigend. In Grafik 1 kann man sehen, dass die größte individuelle Streuung in G3 lag, hervorgerufen durch drei Ovarien mit einer Primordialfollikelanzahl über 200, daher wurde das Maximum mit 270,33 nicht als Ausreißer gewertet (Max G1 = 163 (Extremwert); G2 = 129; G3 = 270,33; G4 = 185,33).
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
Grafik 2: Primordialfollikel, verteilt auf die jeweiligen Gruppen
Auch nahm die Anzahl an Primärfollikeln mit der Zunahme an CL-Gewebe ab (Mediane (Q1/ Q2) G1 = 32,67 (24,67/ 46,67); G2 = 48,67 (34,83/ 77,67); G3 = 62 (21,67/ 106,33);
G4 = 65 (61/ 151,67). Nur eines der drei Ovarien in G3, die auch hohe Primordialfollikelanzahlen hatten, zeigte ebenfalls hier eine deutlich über dem Median liegende Anzahl an Primärfollikeln.
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
Extremwerte
1 2 3 4
Gruppe
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Durchschnitt aller Primärfollikel
Grafik 3: Primärfollikelanzahlen je Gruppe
Das Verhältnis zwischen Primordialfollikeln und Primärfollikeln der Mediane lag in den Gruppen 1 bis 3 zwischen 1,05 und 1,12, während G4 mit 1,70 einen deutlich zu den Primordialfollikeln hin verschobenen Quotienten der Mediane hatte (M-W-U-Test G1 zu G4 p = 0,032).
4. Ergebnisse 26
Grafik 4: Primordial- und Primärfollikel im Verhältnisvergleich
4.2.3 Sekundärfollikel
Die Gesamtzahl an Sekundärfollikeln I war in G1-3 (Mediane (Q1/ Q2): G1 = 11 (7,67/ 14);
G2 = 10 (8,16/ 16,33); G3 = 13 (8/ 17,67)) ähnlich hoch, in G4 war der Median etwas niedriger (G4 = 8,33 (3,33/ 12)). Im Verhältnis zu den Primärfollikeln waren somit in G1 33,67%, in G2 20,55%, in G3 20,97% und in G4 12,82% Sekundär-I-Follikel vorhanden. Im Verhältnis zu den Primordialfollikeln waren in G1 26,19%, in G2 17,91%, in G3 18,23% und in G4 5,82% Sekundär-I-Follikel vorhanden.
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
Durchschnitt aller Sekundär - I - Follikel
Grafik 5: Sekundärfollikel-I-Anzahl je Gruppe
Primordialfollikel
Grafik 6: Vergleich der verschiedenen Follikelstadien der jeweiligen Gruppe
4. Ergebnisse 28 Das gleiche galt für Sekundärfollikel II (G1 = 7,67 (2,67/ 10,67); G2 = 7 (5/ 10,17); G3 = 7 (4/ 10,67); G4 = 5,33 (2,67/ 10,67)). Im Verhältnis zu Primärfollikeln waren in G1 23,48%, in G2 14,38%, in G3 11,29% und in G4 8,20% Sekundärfollikel II vorhanden. Im Verhältnis zu den Primordialfollikeln waren es in G1 18,26%, G2 12,54%, G3 9,81% und G4 3,72%.
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
Extremwerte
1 2 3 4
Gruppe 0
5 10 15 20 25 30
Durchschnitt aller Sekundär - II - Follikel
Grafik 7: Sekundärfollikel-II-Anzahl je Gruppe
Bei den Sekundärfollikeln I gab es in G4 keine atretischen Follikel und im Median war von G3 nach G1 ein leichter Anstieg zu verzeichnen. Sekundärfollikel II, die atretisch waren, waren in allen Gruppen im Median ähnlich, doch lag die Spannweite in G1 deutlich höher als in G2 bis G4 (G1 = 7,67; G2 = 3,00; G3 = 2,33; G4 = 2,67).
Median aller
Grafik 8: Anteil an atretischen Sekundärfollikeln I an der Gesamtmenge von Sekundärfollikeln I (bezogen auf die Mediane)
Grafik 9: Anteil an atretischen Sekundärfollikeln II an der Gesamtmenge von Sekundärfollikeln II (bezogen auf die Mediane)
4.2.4 Tertiär- und Graafsche Follikel
Tertiär- und Graafsche Follikel waren in allen Gruppen im Median ohne erkennbare Tendenz auf gleichem Niveau.
4. Ergebnisse 30
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
Extremwerte
1 2 3 4
Gruppe 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Durchschnitt aller Tertiär- und Graafschen Follikel
Grafik 10: Anzahl der Tertiär- und Graafschen Follikel je Gruppe
Abbildung 7: HE-Färbung, flache Theka Abbildung 8: HE-Färbung; runde Theka
signifikante Abhängigkeit von der Menge an CL-Gewebe insgesamt (r = 0,29, p = 0,039).
Median aller Tertiär- und Graafschen Follikel
Median aller Tertiär- und Graafschen Follikel atretisch
Grafik 11: Anteil atretischer Tertiär- und Graafschen Follikel an der Gesamtzahl (bezogen auf die Mediane)
Tertiär- und Graafsche Follikel, die eine flache Theka hatten und zeitgleich atretisch waren, waren im Median nur in G1 zu finden.
Mediane aller Tertiär- und Graafschen Follikel mit flacher Theka
Mediane aller Tertiär- und Graafschen Follikel
Grafik 12: Anteil an atretischen Tertiär- und Graafschen Follikel mit flacher Theka an der Gesamtzahl der Tertiär- und Graafschen Follikel mit flacher Theka (bezogen auf die Mediane)
4. Ergebnisse 32 Dagegen waren Tertiär- und Graafsche Follikel mit runder Theka, die gleichzeitig atretisch waren, in allen Gruppen zu finden. Im Median waren diese auf ähnlichem Niveau.
Mediane aller Tertiär- und Graafschen Follikel gesamt
Mediane aller Tertiär- und
Graafschen Follikel mit runder Theka
Grafik 13: Anteil Tertiär- und Graafscher Follikel mit runder Theka an der Gesamtanzahl (bezogen auf die Mediane)
Mediane aller Tertiär- und Graafschen Follikel mit runder Theka
Mediane aller Tertiär- und Graafschen Follikel
Grafik 14: Anteil an atretischen Tertiär- und Graafschen Follikel mit runder Theka an der Gesamtzahl der Tertiär- und Graafschen Follikel mit runder Theka (bezogen auf die Mediane)
Runde Thekazellen
Atretische Granulosa-zellen
Abbildung 9: Atretischer Tertiärfollikel mit runder Theka
4.2.5 Atresie allgemein
Die Gesamtzahl aller Follikel nahm, vor allem durch die Anzahl an Primordialfollikeln beeinflusst, mit zunehmendem Lutealgewebe ab (Mediane/ Q1/Q2:
G1 = 109,67/ 78,67/ 141,67; G2 = 121,33/ 105,17/ 169,17; G3 = 161,00/ 60,67/ 319,67;
G4 = 233,17/ 114,33/ 295,00); dabei war auch die Quartil-Spannweite vor allem in G3 und G4 deutlich größer als in G1 und G2 (G1 = 63,00; G2 = 64,00; G3 = 259,00; G4 = 180,67).
4. Ergebnisse 34
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
alle atretischen Follikel ab Sek. I Stadium
Grafik 15: Summe aller atretischen Follikel (ab Sekundärstadium) je Gruppe
Obwohl der prozentuale Anteil an atretischen Follikeln, bezogen auf alle Follikelstadien bis auf G4, auf ähnlichem Niveau war, so zeigte sich doch, dass nur G1 auch atretische Follikel mit flacher Theka aufzeigte und in G4 keinerlei Atresie im Sekundärstadium I aufkam. Auch im Stadium der Tertiär- und Graafschen Follikel waren in G4 deutlich weniger Follikel atretisch als in den anderen Gruppen. Obwohl im Median in G1 kein großer Unterschied zu den anderen Gruppen zu verzeichnen war, zeigte sich in G1 eine große Spannweite (18,67) und in G4 ein niedriger Median. Verglichen mit der Anzahl an heranreifenden Follikeln gehen in G4 ähnlich viele Follikel in die Atresie.
Tabelle 2: Prozentuale Verteilung der atretischen Follikel ab Sekundär-I-Stadium
G1 G2 G3 G4 Prozentualer Anteil der atretischen Follikel,
bezogen auf Follikelstadien ab Sekundär-I
(Mediane) 22,98% 23,30% 23,54% 17,07%
Die absolute Gesamtzahl der atretischen Follikel zeigte zwischen G1 und G4 einen signifikanten Unterschied (M-W-U-Test p = 0,043).
4.3.1 Weitere Abhängigkeiten zum CL-Gewebe
Aufgrund der bereits festgestellten Abhängigkeiten des ovariellen CL-Gewebes mit der Follikelentwicklung suchten wir nach weiteren auch nicht ovariellen Faktoren, die eine Abhängigkeit zum CL-Gewebe haben und damit zur Herleitung weiterer funktioneller und kausaler Zusammenhänge beitragen.
Vor allem das Gewicht, die Blutfettwerte, insbesondere die Triglyzeride und die im Blut messbaren Hormonspiegel waren von Interesse.
Dabei stellte sich heraus, dass sowohl die Gesamtmenge an CL-Gewebe signifikant vom Gewicht der Tiere abhing (r = 0,47, p = 0,001), als auch die alleinige großzellige CL-Menge (nur im Bezug auf Tiere mit großzelligem CL-Gewebe) (r = 0,47, p = 0,012).
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
Grafik 16: Gewichtsverteilung der Tiere bezogen auf die Gruppen
4. Ergebnisse 36
300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 Gewicht (g)
Grafik 17: Gesamt-CL-Gewebe in Abhängigkeit zum Gewicht
300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 Gewicht (g)
Grafik 18: großzelliges CL-Gewebe in Abhängigkeit vom Gewicht
Außerdem stellte sich auch der Zusammenhang zwischen dem gesamten CL-Gewebe und Triglyzeriden dar (r = 0,39, p = 0,010).
Zusätzlich zeigte die Anzahl der atretischen Follikel eine hoch positive Korrelation zum Gewicht der Tiere mit p =0,004 und r = 0,41.
300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 Grafik 19: Atretische Follikel in Abhängigkeit zum Gewicht
Weiterhin standen auch die beiden Blutparameter der Steroidhormone Gesamtöstrogen in der FP: r = 0,41, p = 0,008 und Androstendion in der FP: r = 0,38, p = 0,013 in einem signifikanten Zusammenhang mit der Menge an CL-Gewebe.
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Grafik 20: positive Korrelation Östrogenwerte in FP und Gesamt-Gewebe (auch Tiere ohne CL-Gewebe eingeschlossen)
4. Ergebnisse 38
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Androstendion (ng/ml) in FP
Gesamt Cl-Gewebe (mm²)
Grafik 21: Zusammenhang Androstendion in FP zu Gesamt-CL-Gewebe (auch Tiere ohne CL-Gewebe eingeschlossen)
4.3.2 Beziehungen des durchlöcherten Stromas zu CL-Gewebe und anderen nicht-ovariellen Co-Variablen
In der Fläche des durchlöcherten Stromas zeigte sich ebenfalls eine Abhängigkeit zu dem Gesamt-CL-Gewebe. So waren in G1-3 die Mediane deutlich höher als in G4 - wobei auch eine Steigerung von G2 und G3 zu G1 zu sehen war. Die Mediane (in mm²) lagen bei G1 = 4,05, G2 = 3,02, G3 = 3,44, G4 = 1,85. Prozentual auf die Schnittgrößen bezogen, waren es (ebenfalls auf die Mediane bezogen) G1 = 23,48%, G2 = 21,16%, G3 = 23,50%, G4 = 17,93%.
Abbildung 10: Durchlöchertes Gewebe in HE-Färbung dargestellt
Median 25%-75%
Bereich ohne Ausreißer Ausreißer
Extremwerte
1 2 3 4
Gruppe
0 2 4 6 8 10 12
durchlöchertes Gewebe absolut (mm²)
Grafik 22: Verteilung des durchlöcherten Gewebes in mm²
4. Ergebnisse 40
Grafik 23: Anteil des durchlöcherten Gewebes an der gesamten Schnittgröße (Mediane)
Grafik 23: Anteil des durchlöcherten Gewebes an der gesamten Schnittgröße (Mediane)