5. Diskussion
5.2 Beurteilung der Charakterisierung
und ihre Abgrenzung zu adulten Zellen nichts ausgesagt. Um diesem Umstand gerecht zu werden, werden die Begriffe CFC und CDC verwendet. Sie sollen in dieser Studie die gesamte Zellpopulation, welche zur Bildung einer Kardiosphäre führt bzw. die sich aus den Kardiosphären entwickeln kann (inklusive fibroblastenartiger Zellen) beschreiben. Der positive Einfluss der konditionierten Überstände aus den hier angelegten Kulturen (die zweifelsfrei Mischkulturen sind), widerspricht dieser Darstellung nicht, gibt es doch diverse Untersuchungen zur parakrinen Wirkung von Fibroblasten und Endothelzellen.118 Wie hoch der Anteil der jeweiligen Zellpopulation an den hier aufgezeigten Einflüssen auf die Zytokinsekretion bzw. die Verkürzung isolierter ventrikulärer Kardiomyozyten ist, kann nicht definiert werden.
Nachweis von vWF in den CFC/CDC kann nicht eindeutig einer Differenzierungsleistung möglicher Stamm-/Progenitorzellen zugeschrieben werden, denn eine Entscheidung darüber, ob es sich um adulte Zellen oder differenzierte Progenitorzellen handelt, ist nicht zu treffen. Zudem konnte der Nachweis nicht reproduziert werden. Bestätigend beschreibt eine Untersuchung von Davis et al. den Auswuchs in Primärkulturen ebenfalls als gemischte Zellpopulationen. Hinweise auf eine kardiale Differenzierung konnten bereits 2009 gezeigt werden. In der von mir durchgeführten Studie konnten diese Ergebnisse nicht erzielt werden. Mögliche Gründe hierfür könnten die bereits erwähnten Unterschiede im Ausgangsmaterial oder die Kultivierungsmethode sein.121
Die PCR-Ergebnisse sind insofern interessant, als dass hier Stammzellmarker sowohl in humanen Herzgewebeproben als auch zu den Zeitpunkten Trypsinierung und Ernte nachweisbar sind. Die Erhöhung des Markers c-Kit in den Stichproben zum Trypsinierungszeitpunkt entspricht Untersuchungen von Davis et al., nach welchen der Anteil der c-Kit positiven Zellen der Ratte nach drei Wochen Kultivierung am höchsten war.122 Der uneinheitliche Nachweis der Expression von Stammzellmarkern im Ganzherzen und in der Zellkultur gibt Anlass zu Spekulationen: so gibt es z.B. die Studie von Pouly et al., nach der die Anzahl der c-Kit positiven Zellen in Kultur sehr gering ist und sie zudem als Mastzellen identifiziert wurden.123 Hinzu kommt, dass die untersuchten Marker nicht nur auf Stammzellen exprimiert werden.124 In dieser Studie muss zudem berücksichtigt werden, dass die Proben sehr heterogen sind, was die hohe Streuung erklären könnte. Dennoch werden insbesondere die Ergebnisse der abhängigen Stichproben als Hinweis auf die Existenz von Zellen mit erweitertem Potential gewertet, unabhängig davon, ob es sich hierbei um kardiale Progenitorzellen oder Zellen anderen Ursprungs handelt.
Spekulativ könnte eine verminderte Expression von Stammzellmarkern hin zu mesenchymalen Markern ein Hinweis auf eine partielle Differenzierung der Zellen sein.
121 Vgl. Davis, D. R. et al., Validation of, 2009, S. e7195; vgl. dazu auch Maxeiner, H. et al., New insights, 2010, S. 730-737.
122 Vgl. Davis, D. R. et al., Isolation and, 2010, S. 312–321.
123 Vgl. Pouly, J. et al., Cardiac stem, 2008, S. 673–678.
124 Vgl. Anversa, P. et al., Myocyte renewal, 2002, S. 240–243.
Die Ergebnisse zu den Markern mesenchymaler Zellen (Vimentin, FSP) sind konträr, gleichwohl sie sowohl zum Trypsinierungs- als auch zum Erntezeitpunkt nachweisbar sind: Die Expression von Vimentin ist im Ganzherzen am niedrigsten, von FSP hingegen am höchsten. Wodurch dies bedingt ist, lässt sich so nicht sagen, allerdings entspricht der Nachweis zum Trypsinierungs- und Erntezeitpunkt der Feststellung, dass sich eine Mischkultur auf den Schalen befindet. Als Ausdruck einer basalen Expression ohne Stimulus durch eine Hypoxie wird die nahezu konstante Expression von VEGF gewertet.
Neben der Diskussion um die geeigneten Marker zur Identifizierung kardialer Progenitorzellen im engeren Sinne, bleibt die Frage des Entwicklungspotentials nach Stimulation, wie hier exemplarisch über 5-Azacitidin durchgeführt. Eine Progenitorzellpopulation sollte in der Lage sein, zu differenzieren und dies im Falle der Differenzierung zu Kardiomyozyten z.B. in einer erhöhten Expression von Proteinen des kontraktilen Apparates oder noch weitergehend in der Ausbildung einer Sarkomerstruktur zeigen. Das Fehlen dieser Nachweise könnte zum einen in ungeeigneten Umgebungsmilieus begründet zum anderen aber auch Ausdruck fehlenden Entwicklungspotentials sein. Zudem zeigt sich, dass wiederum Vimentin in dieser Kultur nachweisbar ist, so dass dies den hohen Anteil mesenchymaler Zellen bestätigt. Die Erhöhung der Vimentinexpression nach Stimulierung mit 5-Azacitidin kann nicht eindeutig erklärt werden, da dies, bedingt durch den exemplarischen Versuchsaufbau, zufällig geschehen sein könnte. Zudem lässt sich nicht sagen, ob die Erhöhung in einer Differenzierung kardialer Progenitorzellen im engeren Sinne begründet, oder Ausdruck eines Umbauprozesses aller auf den Schalen wachsender Zellen ist.
Die Beurteilung der funktionellen Eigenschaften der CFC/CDC ergibt folgendes Bild:
Stellt man die Ergebnisse des „Zellkulturmediums nach Trypsinierung“ einer reinen Kontrolle und den konditionierten Überständen gegenüber, ergibt sich in den hier untersuchten Zelllinien eine tendenzielle Verbesserung auf das Zellverkürzungsverhalten der isolierten ventrikulären Kardiomyozyten durch den konditionierten Überstand. Leider konnte in dem hier gewählten Auswertungsverfahren keine statistische Signifikanz nachgewiesen werden.
Möglicherweise sezernieren die CFC/CDC dieser Kulturen dennoch parakrine
Faktoren, welche diese tendenzielle Verbesserung zur Folge haben können. Der zu Grunde liegende Mechanismus könnte über ein verbessertes Kalziumhandling (SERCA/NCX-Verhältnis) vermittelt werden.125 Andere Optionen wären die Beeinflussung der an der Kontraktion beteiligten Proteine (z.B. Troponin) oder die Induktion verschiedener Gene in den Kardiomyozyten. Bei letzterem ist allerdings zu berücksichtigen, dass der Effekt innerhalb von 24 Stunden erreicht sein müsste, da dies der Dauer der Stimulation der Kardiomyozten mit den konditionierten Überständen bzw. dem Medium entspricht.
Es muss zusätzlich berücksichtigt werden, dass nicht alle Zelllinien diesen tendenziellen positiven Effekt im normoxischen konditionierten Überstand gegenüber dem Medium aufweisen. Gründe für diese Abweichung können die statistische Auswertungsmethode, das unterschiedliche Ausgangsmaterial oder methodische Fehler sein. Letzteres insofern, als dass das Verfahren der Standardisierung der verwendeten Überstände diskutabel ist: wurden für die funktionelle Charakterisierung gleiche Volumina unabhängig von der tatsächlichen Zellzahl bzw. des Totalproteingehaltes verwendet, so folgt in den Hypoxieversuchen (Modell B und C) eine Standardisierung auf den gemessenen Totalproteingehalt. Nur bei gleicher Zellzahl und angenommenem gleichen Proteingehalt lässt sich im ersten Ansatz erschließen, welche Zelllinie „wirkungsvollere“ Substanzen sezerniert. Problematisch ist dieser Ansatz allerdings insofern, als dass die Zellzahl zu dem Zeitpunkt nicht standardisiert ist und die Zusammensetzung der Zellen unklar bleibt. Es kann also kein Rückschluss auf einen höheren Anteil an potenten kardialen Progenitorzellen gezogen werden. Zudem ist die tatsächlich sezernierte Proteinmenge (respektive Zytokinmenge) nicht vorhersehbar. D.h. selbst bei exakter Übereinstimmung der Zellzahl folgt nicht automatisch die Sezernierung der gleichen Zytokinmenge. Eine Normierung der konditionierten Überstände auf die Zellzahl birgt somit das Risiko ungleiche Proteinmengen/Zytokinmengen auf die ventrikulären Kardiomyozyten zu geben. Die gemessene Verbesserung der Zellverkürzung könnte also z.B. auf einer höheren Menge und nicht auf wirksameren Zytokinen beruhen. Bei der Standardisierung auf den Totalproteingehalt geht man zwar diesen Schwierigkeiten aus dem Weg, allerdings bleibt die Frage, inwiefern der Totalproteingehalt tatsächlich repräsentativ für die sezernierte Zytokinmenge ist und ob somit ein adäquates Aliquot
125 Vgl. Maxeiner,H. et al., New insights, 2010, S. 730–737.
ausgewählt wird. Mögliche potente Zytokine könnten aufgrund falsch hoher Messwerte des Totalproteins in zu niedriger Konzentration vorliegen. Bei beiden Methoden bleibt offen, ob die Effekte tatsächlich durch Zytokine oder doch durch andere Proteine (die Überstände enthalten FCS) verursacht werden. Unterschiede in der Zellverkürzung bedingt durch das Medium könnten auf unterschiedliche Zusammensetzungen des enthaltenen FCS zurückzuführen sein.
Demnach bleibt abschließend zu sagen, dass ein Beweis für die Existenz von kardialen Progenitorzellen im engeren Sinne nicht erbracht ist, gleichzeitig aber das tatsächliche Entwicklungspotential der hier vorliegenden Zellen und die Zusammensetzung der Kultur kritisch zu hinterfragen sind.
5.3 Beurteilung der Hypoxieversuche