5.2.1. Ussingkammer-Technik
Für eine aussagekräftige Darstellung der Calcium- und Phosphat-Bewegungen ist die Erhaltung eines funktionsfähigen Epithels ausschlaggebend. Rückschlüsse auf die intakte Integrität sowie Vitalität der gastrointestinalen Präparationen konnten unter anderem anhand der erfassten Gewebeleitfähigkeiten sowie der Kurzschlussströme gemacht werden (siehe 4.5.1).
Als weitere Vitalitätskontrolle diente für das Darm- und das Pansenepithel die Zugabe von Forskolin bzw. Ouabain. Die in Abschnitt 3.3.2.3 erläuterte Wirkungsweise dieser beiden Substanzen konnte bei den im Rahmen dieser Arbeit verwendeten intestinalen Epithelien bzw. beim Pansenepithel sowohl der Schafe als auch der Ziegen beobachtet werden. Somit ist anzunehmen, dass alle Epithelien bis zum Ende des Versuchs funktionsfähig waren.
Neben den unidirektionalen Calcium- und Phosphat-Fluxraten wurde ebenfalls der Transport von Mannit über das gastrointestinale Epithel bestimmt. Durch seinen nachweislich passiven Transport (DAWSON 1979; SCHRÖDER et al. 1997) wird es üblicherweise als Marker für den parazellulären Transport eingesetzt.
5.2.2. Quantitative RT-PCR
Mit Hilfe der TaqMan®-PCR wurde der Effekt der Laktation auf die mRNA-Expression von TRPV6 und PMCA bei den Schafen und Ziegen quantitativ erfasst. Zur
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trockengestellten und laktierenden Tieren unterschied (nicht dargestellt), liegt die Vermutung nahe, dass die Laktation keinen Effekt auf die GAPDH-Expression hatte, so dass infolge dessen der Einsatz als interner Standard möglich war.
5.2.3. Western-Blot-Analyse
Der Einfluss der Laktation auf die Calcium-transportierenden Strukturen sowie auf die Expression von NaPi-IIb wurde auf Protein-Ebene mit Hilfe der semiquantitativen Western-Blot-Analyse erfasst. Es wurden immer nur Banden einer Membran miteinander verglichen, da diese unter den gleichen Bedingungen erzeugt wurden.
Eine Normalisierung fand mit den internen Standards Villin und β-Actin statt.
Letzteres wurde bei der Detektion von NaPi-IIb im Jejunum der Ziegen (siehe 4.7.1.4) eingesetzt, da aufgrund der Nähe der Villin-Bande zu der dort detektierten Bande keine exakte Trennung und damit auch keine genaue Vermessung der einzelnen Bande vorgenommen werden konnte. Aufgrund der schlechten Darstellbarkeit von Villin in Präparationen des Pansens, fand eine Normalisierung der ruminalen PMCA-Expression ebenfalls mittels β-Actin statt. Da sich Hinweise darauf ergeben haben, dass der β-Actin-Nachweis schon bei einer Proteinmenge von weniger als 15 µg nicht mehr linear verläuft und daher bei den verwendeten Proteinmengen von 40 µg bzw. 50 µg nicht exakt genug ist Unterschiede der Proteinbeladung zu detektieren (DITTMER u. DITTMER 2006), wurde aufgrund dessen beim Nachweis von TRPV6 sowie PMCA im Darm Villin als interner Standard verwendet. Durch die Normalisierung mit β-Actin konnte bei der Detektion von NaPi-IIb im Jejunum der Ziegen ein zuvor ohne Normalisierung ermittelter signifikanter Unterschied zwischen trockengestellten und laktierenden Tieren nur noch tendenziell nachgewiesen werden. Die Ergebnisse des PMCA-Nachweises im Pansen beider Spezies blieben von der β-Actin-Normalisierung unbeeinflusst. Da sowohl Villin (BRETSCHER u. WEBER 1979) als auch β-Actin (HOOCK et al. 1991) als Strukturproteine der Zellmembranen nicht im Cytoplasma vorkommen, wurde im Fall der Calbindin-D9k-Detektion kein interner Standard verwendet und die Expression bezogen auf die aufgetragene Proteinmenge (siehe Tab. 3.7) ermittelt.
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Bei der Detektion von TRPV6 fiel auf, dass die auf mRNA-Ebene nachgewiesene erhöhte Expression von TRPV6 im Duodenum und Jejunum laktierender Ziegen (siehe 4.6.1 und 4.6.2) nicht mit einer entsprechenden Veränderung auf Protein-Ebene (siehe 4.7.2.1 und 4.7.2.2) einherging. Der im Rahmen dieser Arbeit verwendete Antikörper wurde aus dem Kaninchen generiert und ist gegen das C-terminale Ende des TRPV6-Proteins gerichtet. Ein ebenfalls gegen die letzten 19 Aminosäuren des C-terminalen Endes von TRPV6 gerichteter Antikörper wurde von ZHUANG et al. (2002) an humanen embryonalen Nierenzellen verwendet. Neben einer Bande bei 86 kDa, welche vermutlich einer glykosylierten Form von TRPV6 entspricht (HOENDEROP et al. 2003), wurde dabei außerdem eine weitere Bande mit einer Höhe von 160 kDa nachgewiesen. Das entsprechende Protein wurde als Early endosomal antigen 1 (EEA 1) identifiziert, welches im Cytosol und in den Zellmembranen vorkommt. Da bei diesem Protein keine TRPV6-ähnlichen Sequenzen nachgewiesen werden konnten, ist die Ursache für die Kreuzreaktion mit TRPV6 bisher unklar. Die nicht exakte Spezifität des im Rahmen dieser Arbeit verwendeten TRPV6-Antikörpers könnte möglicherweise eine Erklärung für die nicht zu der TRPV6-mRNA-Expression passenden Ergebnisse der Western-Blot-Analyse sein. Fraglich bleibt hierbei allerdings, ob das EEA 1 aufgrund seiner wesentlich höher gelegenen Bande verantwortlich für eine Störung des TRPV6-Nachweises sein kann. Als eine weitere zugrunde liegende Ursache könnte auch eine Beeinflussung durch die Membranpräparation (siehe 3.4.3) in Betracht gezogen werden.
Bei der Detektion des PMCA-Proteins wurden analog zu früheren Untersuchungen (MROCHEN 2010) zwei dominante Banden auf einer Höhe von 140 kDa bzw. 80 kDa ermittelt sowie mehrere schwächere Banden in dem zwischen den beiden Banden gelegenen Bereich (siehe Abb. 4.23). Mit Hilfe einer spezifischen Antikörper-Blockade konnte bereits die Spezifität beider Banden für PMCA bestätigt werden
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ausgeprägt war und die diffusen Banden zwischen 80 kDa und 140 kDa nicht detektierbar waren. Entsprechend den Angaben von MROCHEN (2010) konnte auch bei der hier vorliegenden Arbeit im Pansen, in welchem sich keine entsprechenden Enzyme befinden, nur die 140 kDa-Bande detektiert werden.
Bei der Detektion des NaPi-IIb-Proteins konnte im Jejunum der Ziegen eine Bande (siehe Abb. 4.25) nachgewiesen werden, die in etwa in dem Bereich lag, der bei vorangegangenen Detektionen für NaPi-IIb angegeben wurde (MUSCHER 2006). Da jedoch bis zu diesem Zeitpunkt kein antigenes Peptid vorlag, konnte keine spezifische Antikörper-Blockade durchgeführt werden, um die beschriebene detektierte Bande eindeutig dem NaPi-IIb-Protein zuzuordnen. Bisher wurde davon ausgegangen, dass bei der Ziege NaPi-IIb nur im Jejunum exprimiert wird (HUBER et al. 2002), während für das Schaf bisher noch keine entsprechenden Daten über den Nachweis von NaPi-IIb im Dünndarm vorliegen. Daher müssen die ermittelten Expressionsdaten unter kritischem Vorbehalt interpretiert werden.
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