Optimierung der PRS-Elution (Box-Behnken-Versuchsplan)

Bei der Optimierung von Methoden ist es oft notwendig, mehrere Parameter zu betrachten, die einen Einfluss auf das gewünschte Endergebnis besitzen können.

Die statistische Versuchsplanung bedient sich mathematischer Modelle, um den Einfluss einer großen Anzahl verschiedener Parameter bei möglichst geringem Aufwand zu überprüfen.

Für die Versuchsplanung müssen zunächst Ziel- und Einflussgrößen festgelegt werden. Die Zielgröße definiert das Resultat der Versuchsoptimierung, bei dem es sich z.B. um eine Ausbeutemaximierung oder eine Arbeitszeitminimierung handeln

kann. In diesem Fall stellt die Zielgröße die Maximierung der Wiederfindungsraten für die Elution der OH-TRP-Isomere von dem PRS-Kationenaustauscher dar. Unter den Einflussgrößen versteht man die Parameter, von denen die Zielgröße abhängig ist.

Diese als Faktoren bezeichneten Einflussgrößen sind z.B. pH-Wert, Reagenzien-konzentration und Reaktionsdauer. Die Faktoren lassen sich meistens empirisch ermitteln. In diesem Fall zeigte sich bereits bei den Versuchen mit verschiedenen Kationenaustauschern (siehe Kapitel 5.2.2), dass die Parameter Ionenstärke, pH-Wert und Modifieranteil mögliche Einflussgrößen für die PRS-Elution darstellen.

Zur Planung und statistischen Auswertung eines Versuches sind drei verschiedene mathematische Modelle beschrieben worden, die sich zum einen im benötigten experimentellen Aufwand und zum anderen in der Aussagekraft der gewonnenen Informationen unterscheiden.

Bei der OVAT-Methode (One-Variable-At-a-Time) werden alle Parameter schrittweise nacheinander optimiert. Der Nachteil dieser Methode liegt darin, dass Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Faktoren nicht erkannt werden. Da außerdem nur ein sehr enger Ausschnitt aller möglichen Wertekombinationen untersucht wird, handelt es sich bei dem gefundenen Optimum oftmals gar nicht um das tatsächliche Optimum (OTTO, 1997). Bei der Untersuchung mehrerer Parameter kann der experimentelle Aufwand sehr groß werden.

Bei der sequenziellen Optimierung werden die Parameter gleichzeitig untersucht.

Hierbei bauen die Experimente aufeinander auf, so dass der vorherige Versuch die Parametereinstellungen des folgenden Versuches festlegt (Simplexverfahren). Da nur systematisch nach einem Optimum gesucht wird, kommt der Größe der Änderung der einzelnen Parameter von Versuch zu Versuch (Schrittweite) eine besondere Bedeutung zu. Bei einer zu kleinen Schrittweite ist der experimentelle Aufwand sehr groß und es wird möglicherweise nur ein lokales Suboptimum gefunden. Ist die Schrittweite zu groß, wird vielleicht gar kein Optimum gefunden. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass Zusammenhänge zwischen den Zielgrößen und Einflussgrößen nicht näher untersucht werden (OTTO, 1997).

Bei der simultanen Optimierung werden Zusammenhänge zwischen der Zielgröße und den einzelnen Faktoren untersucht. Dazu werden Experimente durchgeführt, die einen bestimmten experimentellen Raum abdecken. Mit Hilfe eines mathematischen Modells können dann aus diesen Ergebnissen die Zielgrößenwerte an allen Stellen

des Raumes vorhergesagt und so das tatsächliche Optimum ermittelt werden (ESBENSEN et al., 1996; OTTO, 1997).

Zur Untersuchung des Einflusses der drei Faktoren Ionenstärke, pH-Wert und Modifieranteil auf die Elution der OH-TRP-Isomere von dem PRS-Kationen-austauscher wurde das Verfahren der simultanen Optimierung gewählt. Dadurch können Aussagen über den Einfluss der einzelnen Faktoren sowie mögliche Wechselwirkungen gemacht werden. Der Aufwand einer Versuchsoptimierung ist von der Anzahl der Faktoren und der gewählten Versuchsstufen abhängig. Der Vorteil von mehreren Versuchsstufen liegt in einem höheren Informationsgewinn. So lassen sich bei der Verwendung von zwei Stufen nur lineare Zusammenhänge erkennen, während bei drei Stufen auch quadratische Zusammenhänge betrachtet werden können. Gleichzeitig mit der Stufenzahl erhöht sich jedoch die Anzahl der durchzuführenden Experimente beträchtlich. Die Anzahl der durchzuführenden Experimente beträgt bei n Stufen und k Faktoren n^k. Ein solcher vollständiger faktorieller Versuchsplan mit zwei Stufen und drei Faktoren läßt sich graphisch als Würfel darstellen, wobei jeder Eckpunkt einer Faktorenkombination (X1, X2, X3) eines Versuches entspricht. Die einzelnen Stufen werden durch die Kodierung +1 bzw. -1 beschrieben und stellen eine Erhöhung bzw. Erniedrigung einer vorher gewählten Standardgröße (0) des entsprechenden Faktors dar.

Für die vorliegende Fragestellung wurde ein Versuchsplan nach Box und Behnken verwendet. Ein dreistufiger Box-Behnken-Plan mit drei Faktoren benötigt insgesamt 15 Versuche (gegenüber 27 bei einem vollständigen faktoriellen Versuchsplan). Die einzelnen Versuche lassen sich graphisch ebenfalls als Würfel darstellen (Abbildung 5.7). Die Punkte befinden sich jedoch nicht an den Eckpunkten sondern in der Mitte der Kanten des Würfels. Ein spezieller Punkt (Zentralpunkt) befindet sich in der Mitte des Würfels. Der Versuch an diesem Punkt wird dreimal ausgeführt, um die versuchsbedingte Streuung der Messwerte zu bestimmen. Aus der berechneten Varianz wird die Signifikanz der Einflussgrößen ermittelt.

Abbildung 5.7 Graphische Darstellung des Box-Behnken-Plans für drei Faktoren und drei Stufen

Im Folgenden werden die Einflussfaktoren näher definiert:

Ionenstärke: Als Elutionspuffer wurde statt des bisher verwendeten Natrium-phosphat-Puffers ein Ammoniumformiat-Puffer verwendet. Die Elutionswirkung beruht auf der Verdrängung der OH-TRP-Isomere durch das Ammoniumion, das eine höhere Affinität zu dem Kationenaustauscher als das Natriumion besitzt. Die Untersuchung wurde für die drei Stufen 25, 50 und 75 mMol/L NH4+

durchgeführt.

pH-Wert: Der pH-Wert des Elutionspuffers wurde im Bereich des optimalen Aufgabe-pH-Wertes 3,5 (siehe Kapitel 5.2.3) untersucht. Es wurden die Stufen pH 2, 3,5 und 5 gewählt.

Modifieranteil: GROSSI et al. (1990) zeigten bei ihren Versuchen zur Festphasenextraktion von Serotonin eine Verbesserung der Elutionseigenschaften des Natriumphosphat-Puffers bei Zusatz von organischem Modifier. Es wurde daher der Einfluss verschiedener Methanolanteile im Elutionsgemisch auf die Elution der OH-TRP-Isomere untersucht. Die Versuche wurden für die Stufen 0, 10 und 20%

Methanol durchgeführt.

Die Aufstellung und Auswertung des Box-Behnken-Plans erfolgte mit dem Programm STATISTICA (STATSOFT, Inc.; Version 5.1). Die ermittelten Wiederfindungsraten für die OH-TRP-Isomere wurden als Zielgrößen den jeweiligen Faktorkombinationen (Versuchen) zugeordnet (Box-Behnken-Versuchsplan, Durchführung und Einzel-ergebnisse siehe Anhang 10.7.3.6).

In Abbildung 5.8 ist ein 3D-Flächenplot des Box-Behnken-Versuchsplans für das 5-OH-TRP dargestellt. Die Wiederfindungsrate des 5-OH-TRP wird in Abhängigkeit von der NH4-Konzentration und dem pH-Wert gezeigt. Der Methanolanteil beträgt

konstant 10%. Die Punkte stellen die einzelnen Messwerte für die 15 Versuche dar.

Der Zentralpunkt in der Mitte der Graphik zeigt exemplarisch für einen Elutionspuffer die Streuung der Messwerte an, aus der sich die Signifikanzen für die einzelnen Faktoren berechnen.

65,541 69,073 72,606 76,139 79,672 83,205 86,737 90,27 93,803 97,336 über

Auswertung BOX-BEHNKEN-Versuchsplan 3 Stufen, 3 Faktoren, 15 Versuche, Runs durch den Nullpunkt: 3

Zielgröße: Wiederfindung 5-OH-TRP

Abbildung 5.8 3D-Flächenplot für das 5-OH-TRP (Methanolanteil 10%)

Es ist zu erkennen, dass die Wiederfindungsrate deutlich mit der NH4-Konzentration ansteigt. Auch mit ansteigendem pH-Wert ist ein Anstieg der Wiederfindungsrate zu verzeichnen, dieser ist jedoch sehr viel geringer. Der dunkelrote Bereich stellt die Zonen mit einer Wiederfindungsrate größer 97% dar. Es zeigt sich, dass die Wiederfindungsrate bei einer ausreichend hohen NH4-Konzentration über einen großen pH-Bereich praktisch 100% beträgt.

In Abbildung 5.9 ist das Paretodiagramm für das 5-OH-TRP dargestellt. In diesem Diagramm sind die Ergebnisse der statistischen Betrachtung der einzelnen Faktoren jeweils für eine lineare oder eine quadratische Abhängigkeit dargestellt. Signifikante Einflüsse werden durch Überschreitung einer Signifikanzschranke (p=0,05) gezeigt.

Das Diagramm zeigt, dass die NH4-Konzentration (Ionenstärke) sowohl bei Betrachtung der linearen als auch der quadratischen Abhängigkeit einen signifikanten Einfluss ausübt. Für die Faktoren pH-Wert und Methanolanteil ist keine Signifikanz feststellbar. 4- und 7-OH-TRP zeigen analoge Ergebnisse. Auf eine graphische Darstellung wird daher verzichtet.

Paretodiagramm

3 Stufen, 3 Faktoren, 15 Versuche, Runs durch den Nullpunkt: 3 Zielgröße: 5-OH-TRP

Schätzung Effekte (Absolutwert) -,433308

1,413951 1,511467

-1,96938

3,546267

6,636449 p=,05

Methanol(L) pH(L) pH(Q) Methanol(Q) Ammonium(Q) Ammonium(L)

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Abbildung 5.9 Paretodiagramm für das 5-OH-TRP

Für das 6-OH-TRP konnte kein signifikanter Einfluss eines der Faktoren ermittelt werden (Abbildung 5.10). Die Gründe hierfür liegen in der starken Streuung der Wiederfindungsrate am Zentralpunkt (Abbildung 5.11). Aufgrund der höheren Varianz ist eine Signifikanz nicht mehr statistisch belegbar. Ein derartiges abweichendes Elutionsverhalten des 6-OH-TRP gegenüber den anderen Isomeren ist jedoch nicht zu erwarten.

Das 6-OH-TRP zeigt höhere Wiederfindungsraten bei höheren pH-Werten. Dieser Einfluss ist jedoch ebenfalls nicht signifikant.

Paretodiagramm

3 Stufen, 3 Faktoren, 15 Versuche, Runs durch den Nullpunkt: 3 Zielgröße: Wiederfindung 6-OH-TRP

Schätzung Effekte (Absolutwert) -,156539

-,531737 -,826381

-1,34789 1,587234

1,92662 p=,05

Ammonium(L) pH(Q) Methanol(L) MethanolQ) pH(L) Ammonium(Q)

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Abbildung 5.10 Paretodiagramm für das 6-OH-TRP

69,159 71,837 74,516 77,194 79,873 82,552 85,23 87,909 90,587 93,266 über

Auswertung BOX-BEHNKEN-Versuchsplan 3 Stufen, 3 Faktoren, 15 Versuche, Runs durch den Nullpunkt: 3

Zielgröße: Wiederfindung 6-OH-TRP

Abbildung 5.11 3D-Flächenplot für das 6-OH-TRP (Methanolanteil 10%)

Für die drei Faktoren Ionenstärke, pH-Wert und Methanolanteil im Elutionspuffer konnte nur für die Ionenstärke ein signifikanter Einfluss auf die Elution von 4-, 5- und 7-OH-TRP nachgewiesen werden. Für das 6-OH-TRP konnte dieser Zusammenhang nicht statistisch bewiesen werden. Die beste Elution sollte demnach mit einem Ammoniumformiat-Puffer möglichst hoher Ionenstärke ohne Modifieranteil im pH-Bereich von 3 - 5 erreicht werden. Um das Elutionsvolumen von 5 mL auf 1,5 mL reduzieren zu können, wurde im Folgenden die Elution von dem PRS-Kationenaustauscher mit einem Ammoniumformiat-Puffer (200 mMol, pH 3) durchgeführt. Dadurch konnte auf den Schritt der Lyophilisierung verzichtet werden.