Bestimmung spezifischer Transkriptmengen durch RNA-DNA-

Bei der Northern Blot Analyse wird durch Gelelektrophorese aufgetrennte RNA auf eine Nylonmembran übertragen, auf der dann die Menge spezifischer Transkripte durch Hybridisierung der gebundenen RNA mit radioaktiv markierten spezifischen cDNA-Sonden quantifiziert werden kann (DNA/RNA-Hybridisierung).

2.23.1 Denaturierende Elektrophorese von RNA in formaldehydhaltigen Agarosegelen

Die RNA für den Northern Blot wurde unter denaturierenden Bedingungen im 1,5 %-igen Formaldehyd-Gel mit 1 x N-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)-Puffer elektrophoriert. Nach dem Aufkochen wurde die Agarose unter Rühren auf etwa 50 °C abgekühlt, dann wurden 3 mL 37 %iges Formaldehyd/100 mL hinzugefügt (Endkonzentration 1,11 %). Anschließend wurden die Gele gegossen und für 1-2 h auspolymerisieren gelassen. RNA-Proben geringer Konzentration, die bei einer Menge

von 20 µg ein größeres Volumen als 10 µL besaßen, wurden lyophilisiert (Lyophilisator Lyovac GT 3, Leybold Heraeus, Hanau, Deutschland) und anschließend in 10 µL DEPC-ddH2O aufgenommen. Die RNA wurde mit je 12,5 µL Formamid (65,79 % (v/v)), 2,5 µL 10 x MOPS-Puffer (13,16 % (v/v)) und 4 µL Formaldehyd (21,05 % (v/v)) versetzt und für 15 min auf 65 °C erhitzt, um Sekundärstrukturen zu denaturieren. Anschließend wurden die Proben sofort auf Eis abgekühlt. Vor dem Auftragen wurden die Proben jeweils mit 3 µL 6 x Ladepuffer (0,1 % Xylencyanol, 580 mM Saccharose, 250 mM EDTA, 0,72 mM Bromphenolblau) versetzt. Nach Beladen des Gels erfolgte die Elektrophorese bei 200 mA für etwa 2,5 h.

2.23.2 Amplifizierung von cDNA-Sonden für Hybridisierungsexperimente Nach Identifizierung der korrekten Plasmid-DNA wurden die cDNA-Fragmente durch PCR amplifiziert.

Der gesamte PCR-Ansatz wurde ungereinigt auf ein präparatives Gel aufgetragen, nach elektrophoretischer Auftrennung mit Ethidiumbromid gefärbt, unter UV-Licht aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Amersham Purification Kit (GE Healthcare, München, Deutschland) nach Herstellerangaben gereinigt. Zur Kontrolle wurden von jedem aufgereinigten Fragment 4 µL DNA-Lösung erneut auf ein Gel aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt und nach Ethidiumbromidfärbung unter UV-Licht fotografiert. Die Sonden wurden ausgehend von cDNA hergestellt. Das ubiquitär exprimierte Gen für β-Aktin (ACT8) ist als Referenzgen anerkannt (Bustin, 2000) und wurde als Beladungskontrolle für die relative Quantifizierung verwendet.

2.23.3 Radioaktive Markierung von cDNA-Sonden

DNA-Sonden wurden über zufälligen Einbau α-[³²P] markierten dCTPs markiert („random priming“). Für die Reaktion wurde das „Megaprime DNA Labelling System“

von Amersham Biosiences nach dem Standardprotokoll des Herstellers verwendet.

Anschließend wurden die Fragmente mit Hilfe von „ProbeQuantumG-50 Micro Columns“ über Gelfiltration aufgereinigt, um nicht eingebaute [³²P] markierte Nukleotide zu entfernen. Nach der Reinigung wurden die Fragmente für 10 min bei 95 °C denaturiert und auf Eis gestellt.

2.23.4 Transfer von Nukleinsäuren aus Agarosegelen auf Nylonmembranen („Blot“)

Um spezifische Transkripte in Gesamt-RNA über RNA-DNA-Hybridisierung nachweisen zu können, musste die isolierte RNA elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend auf eine Membran übertragen („Blot“) und fixiert werden. Die für Northern Blots benötigte RNA wurde wie unter 5.21.1. beschrieben aus gefrorenem Pflanzenpulver extrahiert. Die RNA-Extrakte wurden bis zur Gelelektrophorese und Übertragung auf die Membran bei -80 °C gelagert. Um die Proben auf Abbau durch RNAsen zu überprüfen, wurden etwa 10 µg RNA in 1,5 %igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt, die RNA durch Inkubation in Ethidiumbromid-Lösung angefärbt und unter UV-Licht die Konzentration der Banden nach Augenmaß abgeschätzt. Für die Auftragung auf die Blot-Gele wurden ca. 20 µg RNA eingesetzt.

Abbildung. 13: Versuchsaufbau zum RNA-Transfer ("Blot"). RNA wurde wie abgebildet durch die Saugkraft des Filterpapiers mit dem Pufferstrom aus dem Agarosegel auf eine Nylonmembran transferiert. Weitere Details im Text.

Aus den RNA-Gelen wurde die RNA durch Kapillarkräfte auf die Nylonmembran übertragen. Eine Glasplatte wurde als Plattform über zwei mit 20 x SSC-Puffer (300 mM NaCl; 34 mM Na-Citrat; pH 7, eingestellt mit HCl) gefüllte Glasschalen gelegt, auf die Glasschale als Pufferbrücke ein Band aus Fließpapier (Whatman), das an beiden Enden in die mit Puffer gefüllten Glasschalen hineintauchte und mit Puffer getränkt war (s. Abb. 13). Das RNA-Gel wurde mit der zurechtgeschnittenen und in ddH2O angefeuchteten Nylonmembran (Nylonmembran Roti-Nylon 0.2 Transfermembran 0,2 µm; Roth, Karlsruhe, Deutschland) bedeckt. Beim Auflegen wurde darauf geachtet,

Filterpapier Fließpapier Nylonmembran RNA-Gel Plattform

Gewicht

Schale mit 20 x SSC-Puffer

Fließpapier als Pufferbrücke

dass keine Luftblasen eingeschlossen wurden, die den Transfer durch Kapillarkräfte behindern können. Einige Schichten zurechtgefaltetes Fließpapier sowie ein Stapel von 5–10 cm gefaltetem Filterpapier wurden auf die Nylonmembran gelegt, um die dem Transfer zugrunde liegende Saugwirkung zu erzeugen. Auf den Filterpapierstapel wurde eine Glasplatte gelegt, die mit einem Gewicht beschwert wurde. Das Filterpapier um das Gel herum wurde mit Parafilm abgedeckt, um zu verhindern, dass ein Puffersog an Gel und Membran vorbei entsteht. Die Apparatur wurde für etwa 24 h bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei die RNA durch die Saugkraft des Filterpapiers aus dem Gel auf die Membran übertragen wurde. Nach Abbau des Blots wurde die Membran kurz unter ddH2O abgespült und anschließend bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Zur Fixierung der RNA wurden die Membranen für 2 h bei 80 °C gebacken. Danach wurden die Membranen bis zur Hybridisierung bei Raumtemperatur an einem trockenen und dunkeln Ort aufbewahrt.

2.23.5 RNA-DNA-Hybridisierung zur Detektion spezifischer Transkripte auf RNA-Blots

Um unspezifische Bindungen bei der Hybridisierung zu minimieren, erfolgte zunächst die Prähybridisierung. Hierfür wurden die Membranen in Glasröhren mit Schraubverschluss gegeben, in denen sie für 2-3 h bei 65 °C in etwa 30 mL Prähybridisierungspuffer (250 mM Na2HPO4, pH 7,2; 7 % (w/w) SDS; 1 mM EDTA) im Hybridisierungsofen rotierten.

Die Lösungen mit den denaturierten und radioaktiv markierten Sonden wurden direkt zum Prähybridisierungspuffer hinzugegeben; die Hybridisierung erfolgte bei 65 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Membranen zweimal mit einem Puffer niedriger Stringenz („Low Stringency Buffer“: 40 mM Na₂HPO₄, pH 7,2;

5 % (w/w) SDS, 1mM EDTA) bei 65 °C für etwa 30-60 min gewaschen.

2.23.6 Visualisierung der spezifischen Hybridisierungssignale

Die markierten und gewaschenen Membranen wurden für 48 h auf einen Phosphorschirm aufgelegt und mit Hilfe eines Phospho-Imagers (FLA-300, Fujifilm, Düsseldorf, Deutschland) mit der Software BAS-Reader v3.14 (Fujifilm, Düsseldorf, Deutschland) und Aida Image Analyzer v3.24 (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) ausgewertet. Dabei wurde die Hintergrundintensität subtrahiert.

Anschließend wurden die Membranen zusammen mit einem Röntgenfilm (Röntgenfilm Biomax MS Film, Kodak, Stuttgart, Deutschland) in einer Filmkassette bei -80 °C für 21 Tage exponiert, um schwächere Signale hervorzuheben. Die Röntgenfilme wurden mit einem automatischen Röntgenfilmentwickler (Optimax Typ TR, MS Laborgeräte, Wiesloch, Deutschland) entwickelt.

2.24 Transiente Expression fluoreszenzmarkierter Fusionsproteine in