Bestimmung der Schnittstelle des Endolysins von CMP1 im Peptidoglykan von Cmm Die Endolysine von CMP1 und CN77 lysieren sehr spezifisch nur Mitglieder der Gattung

Wenn unterschiedliche Stämme gemischt wurden, konnte nach Zugabe von Endolysin die selektive Eliminierung von Clavibacter beobachtet werden (Abb. 50). Auf Gram-negative Stämme wie z. B. E. coli, Pseudomonas putida oder Aeromonas hydrophila hatten die beiden Enzyme erwartungsgmäß keinen Effekt (Tab. 7, s. Anhang).

Aus den Ergebnissen dieser Versuche lässt sich schließen, dass die Enzyme offenbar eine hohe Spezifität aufweisen und die Aktivität der beiden Endolysine auf die Subspezies von Clavibacter michiganensis limitiert ist. Von außen zugegeben haben sie keinen Effekt auf andere Gram-positive und Gram-negative Bakterienstämme und würden so bei einem Einsatz die bakterielle Gemeinschaft nicht negativ beeinflussen. Damit sind sie für einen potentiellen Einsatz beim biologischen Pflanzenschutz geeignet.

3.7. Bestimmung der Schnittstelle des Endolysins von CMP1 im Peptidoglykan von Cmm

Für die Analyse der potentiellen Schnittstelle der Endolysine wurde zunächst das Peptidoglykan von Cmm in Zusammenarbeit mit der DSMZ in Braunschweig aufgereinigt. Dazu wurden Cmm-Zellen mit Hilfe von Glasperlen in einer Zellmühle aufgeschlossen. Nach einigen Zentrifugations- und Waschschritten wurde die Rohfraktion zunächst mit Trypsin und nach weiteren Waschschritten mit SDS behandelt, bis nach Entfernen des restlichen SDS das Peptidoglykan gereinigt vorlag. Durch die Trypsin- und SDS-Behandlung sollten Proteine, die in der Zellhülle lokalisiert sind, vom eigentlichen Peptidoglykan getrennt werden.

Zur Überprüfung der Reinheit des isolierten Peptidoglykans wurde eine Totalhydrolyse (4 N HCl, 100 °C, 16 h) des aufgereinigten Cmm-Peptidoglykans durchgeführt. Die Identifikation der einzelnen Bestandteile erfolgte über ein Papierchromatogramm (Rhuland et al., 1955).

Standard

PeptidoglykanCmm Diaminobuttersäure

Gly Glu Ala

Laufrichtung

LL-Dpm Dpm Orn Lys

Standard

PeptidoglykanCmm Diaminobuttersäure

Gly Glu Ala

Laufrichtung

LL-Dpm Dpm Orn Lys

Abb. 52 Rhuland-Chromatogramm des Hydrolysates (4N HCl, 100°C, 16h) von Cmm-Peptidoglykan, Spur 1: Standard mit LL-Dimaminopimelinsäure (LL-Dpm), meso-Dimaminopimelinsäure (Dpm), Ornithin (Orn) und Lysin (Lys), Spur 2: Hydrolysat Cmm-Peptidoglykan, Spur 3: Diaminobuttersäure.

Abb. 52 zeigt, dass in dem Hydrolysat des Cmm-Peptidoglykans wie zu erwarten keine Diaminopimelinsäure, dafür aber eindeutig Diaminobuttersäure vorhanden ist. In der Spur der Probe sind Flecken zu erkennen, die von links nach rechts Diaminobuttersäure, Glycin, Glutaminsäure und Alanin repräsentieren. Bei einer Kontamination der Probe mit anderen Proteinen würden rechts vom Alanin weitere Flecken erscheinen. Durch Farbe (rot) und Laufverhalten (fast an der Lösungsmittelfront) würden dabei besonders Leucin und Isoleucin auffallen, die deshalb als Indikator für Protein-Kontamination verwendet werden. Diese treten in dieser Probe nicht auf. Es konnte also die Reinheit des aufgearbeiteten Peptidoglykans gezeigt werden, das somit für die Bestimmung der genauen Schnittstelle des Endolysins eingesetzt werden konnte.

3.7.1. Massenspektrometrische Analyse des Cmm-Peptidoglykans

Für die Bestimmung der Stelle im Peptidoglykan, an der die Phagen-Endolysine enzymatisch wirksam werden, musste zunächst die Struktur einer Untereinheit des Peptidoglykans analysiert werden. Diese besteht aus zwei Disacchariden mit je einem Acetylglucosamin und einer N-Acetylmuraminsäure, die über die für den Zellwandtyp B2γ charakteristischen Peptidstämme quervernetzt werden. Um eine solche Untereinheit zu erhalten, wurde das isolierte Peptidoglykan mit Mutanolysin aus Streptomyces globisporus (Sigma) hydrolysiert (Fliss et al., 1991), das die glykosidischen Bindungen im Peptidoglykan spaltet. Bei einer vollständigen Hydrolyse würde man so ein Molekül erhalten, das aus den Disacchariden zweier Ketten besteht, die durch die Peptide quervernetzt sind.

In einer weiteren Probe wurde das Peptidoglykan zusätzlich mit dem aufgereinigten Endolysin von CMP1 hydrolysiert. Die für die massenspektrometrische Analyse entsalzten Proben wurden zusammen mit Dihydroxybenzoesäure (DHB) als Matrix für glykosylierte Peptide auf Stahlträger getropft und nach dem Kristallisieren massenspektrometrisch analysiert.

Nach der massenspektrometrischen Analyse konnten eindeutige Unterschiede zwischen den beiden Peptidoglykan-Proben festgestellt werden (Abb. 53).

Abb. 53 Massenspektometrische Analyse der hydrolysierten Peptidoglykanproben. Probe A wurde mit Mutanolysin und dem Endolysin von CMP1 behandelt, Probe B wurde nur mit Mutanolysin behandelt.

Die Abbildung zeigt das Massenspektrum im positiven Ionenmodus.

In der Probe, in der das Peptidoglykan mit zwei Enzymen hydrolysiert wurde (Abb. 53, A), treten nur Signale unterhalb von 1100 Da auf. Die in Probe B dominanten Signale von ca. 1856 Da und ca. 1585 Da sind hier nicht zu detektieren. Daher wurde angenommen, dass es sich bei diesen beiden Molekülen um die erwähnten Peptidoglykan-Untereinheiten handeln könnte, die nach der Behandlung mit dem Endolysin von CMP1 hydrolysiert wurden. Anhand der vorgeschlagenen Struktur des Cmm-Peptidoglykans von Kandler und Schleifer (1972) wurde das Molekulargewicht einer möglicherweise nach Hydrolyse mit Mutanolysin auftretenden Peptidoglykan-Einheit ermittelt (Abb. 54).

N-Acetyl-Glucosamin N-Acetyl-Muraminsäure

Gly

Glu

Ala DAB

N-Acetyl-Glucosamin N-Acetyl-Muraminsäure Gly Glu DAB

Ala DAB

N-Acetyl-Glucosamin N-Acetyl-Muraminsäure

Gly

Glu

Ala DAB

N-Acetyl-Glucosamin N-Acetyl-Muraminsäure Gly Glu DAB

Ala DAB

N-Acetyl-Glucosamin N-Acetyl-Muraminsäure

Gly

Glu

Ala DAB

N-Acetyl-Glucosamin N-Acetyl-Muraminsäure Gly Glu DAB

Ala DAB

Abb. 54 Von Kandler und Schleifer ermittelte Struktur einer quervernetzten Cmm-Peptidoglykan-Untereinheit. In dieser Abbildung liegt die N-Acetyl-Muraminsäure in ihrer ofenkettigen Form vor, die Diaminobuttersäure (DAB) des linken Peptidstamms liegt acetyliert vor. Die rot gestrichelte Linie markiert die mögliche Schnittstelle des Endolysins, der linke Teil des Moleküls hätte dann eine Größe von etwa 1017 Da.

Diese hätte ein Molekulargewicht von 1857,79 Da unter Berücksichtigung eines Natrium-Ions bei einer Messung im positiven Modus. Ein Signal, das ungefähr diese Größe aufweist, lässt sich nach

der massenspektrometrischen Analyse (Probe B, Abb. 53) nachweisen, allerdings entspricht es trotz genauer Eichung des Massenspektrometers nicht exakt dem erwarteten Molekulargewicht.

Diese Abweichung konnte trotz mehrmaliger Wiederholung der Messung und Variation der Messparameter nicht vermindert werden. Somit kann also keine zuverlässige Aussage darüber getroffen werden, ob es sich bei diesem Signal tatsächlich um die erwartete Struktur handelt und ob diese vorgeschlagene Struktur der Peptidoglykan-Untereinheit tatsächlich korrekt ist.

Der Ursprung des zweiten dominanten Signals mit einer Größe von ca. 1585 Da konnte ebenfalls nicht eindeutig bestimmt werden. In diesem Fall wurden nach einer erneuten Fragmentierung des Moleküls über eine Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS) Signale erhalten, die nach einem Vergleich mit bekannten Molekülen wahrscheinlich Aminosäuren zugeordnet werden können, die nicht im Peptidoglykan enthalten sind. Das ließ den Schluss zu, dass es sich bei diesem Signal nicht um ein Fragment des Peptidoglykans, sondern vermutlich um eine Verunreinigung handelt (Daten nicht gezeigt).

Bei der Probe, bei der das Peptidoglykan mit Mutanolysin und dem Endolysin von CMP1 hydrolysiert wurde, wurde ein dominantes Signal detektiert, das ein Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 1018 Da repräsentiert (Abb. 53, A). Auch bei diesem Molekül weicht das gemessene Molekulargewicht von dem errechneten Molekulargewicht eines möglichen Fragments ab, so dass auch keine zuverlässige Aussage getroffen werden kann.

Für eine weitere Analyse dieses Moleküls wurde es fragmentiert und weiter untersucht. Nach der Fragmentierung dieses Moleküls wurden verschiedene Fragmente detektiert (Abb. 55).

Abb. 55 MS-MS-Massenspektrum des 1018 Da-Moleküls nach Hydrolyse des Cmm-Peptidoglykans mit Mutanolysin und CMP1-Endolysin. Die Abbildung zeigt das Massenspektrum im positiven Ionenmodus.

Nach der Analyse der Größenunterschiede der verschiedenen Fragmente und dem Vergleich mit bekannten Molekülgrößen, konnten zumindest einigen ein eindeutiges Molekül mit dem jeweiligen Molekulargewicht zugeordnet werden. So könnten Größenunterschiede zwischen den Fragmenten vermutlich auf Abspaltungen von Alanin (A) basieren. Ebenso wurden weitere Differenzen zwischen den Fragmenten den Aminosäuren Glutamat (E) und Glycin (G) zugeordnet. Da bei der Analyse zumindest keine weiteren Größen ermittelt wurden, die auf Aminosäuren hinweisen, die nicht im Peptidoglykan auftreten, kann angenommen werden, dass es sich bei dem 1018 Da-Fragment möglicherweise um ein echtes Fragment des Cmm-Peptidoglykans handelt.

Aufgrund der Abweichung des ermittelten Molekulargewichts dieses Fragments von 1018 Da zu dem errechneten Wert (≈1017 Da) könnte zu diesem Zeitpunkt über die mögliche Schnittstelle des CMP1-Endolysins im Peptidoglykan nur spekuliert werden.Möglicherweise hydrolysiert das Endolysin die Peptidbindung zwischen der quervernetzenden Diaminobuttersäure und dem endständigen Alanin des Tetrapeptidstamms (Abb. 54). In diesem Fall würde ein etwa 1017 Da großes Fragment entstehen. Da die Abweichung der Messung aber zu groß ist, um eine zuverlässige Aussage treffen und zu können und auch das entsprechende kleinere Fragment von ca. 841 Da nicht nachzuweisen ist, ist diese Hypothese nur sehr vage. Zur Ermittlung der genauen Schnittstelle des Endolysins im Peptidoglykan muss zunächst die Struktur einer nach Hydrolyse mit Mutanolysin entstehenden Peptidoglykan-Einheit ermittelt werden. Dazu müssen erst weitere Messungen erfolgen.