Bestimmung der Lipidklassen

2.4.1 TLC-FID

Zum Oberbegriff der Lipide wird eine Reihe von Substanzklassen gezählt, wie z. B. aliphatische Kohlenwasserstoffe, langkettige Alkohole, freie Fettsäuren, Wachs- und Sterolester, freies Cholesterol, Phospholipide und Glykolipide (Karlson, 1990). Herkömmliche Verfahren zur quali-tativen und quantiquali-tativen Bestimmung der Lipidklassen sind Säulen- oder Dünnschichtchromato-graphie mit anschließender gravimetrischer Bestimmung oder photometrischen Methoden (Christie, 1982). Die Bestimmung der Lipidzusammensetzung aus den Hexanextrakten wurde in der vorliegenden Arbeit mit einem Verfahren durchgeführt, welches eine Kombination aus Dünn-schichtchromatographie und Flammenionisationsdetektion (TLC-FID) darstellt.

Die TLC-FID-Methode, welche als stationäre Phase anstatt von Dünnschichtplatten mit gesintertem Kieselgur beschichtete, wiederverwendbare Quarzstäbchen nutzt (Chromarods, S lll, latron Labaratories, lnc., Tokyo, Japan, !52 mm Länge, 0.92 mm Durchmesser), wurde von Ackmann ( 1981) entwickelt. In einem Metallrahmen befinden sich I 0 Chromarods, auf denen die Proben aufgetragen werden. Nach verschiedenen Entwicklungschritten (s. u.) wird der Rahmen im latroscan MK5 (Iatron Labaratories, Inc., Tokyo, Japan) fixiert und die Stäbchen in der Flamme eines Flammenionisationsdetektors ganz oder partiell abgebrannt. Im letzteren Fall folgen weitere Entwicklungen mit anschließendem erneuten Abbrennen. Der Detektor registriert den ent-standenen Stromfluß durch die Verbrennung der getrennten Lipidklassen, die somit mit Hilfe einer Chromatographie-Software registriert und ausgewertet werden können. Die Variations-möglichkeiten dieser Methode bestehen in der Verwendung unterschiedlich polarer Lösungs-mittelgemische und des einfachen oder mehrfachen partiellen Abbrennens (scannen) der Chromarods. Eine von Parrish (1987) entwickelte Methode zur Trennung von 9 Lipidklassen

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40 :-.taterial und :-.tethoden

(s. Tabelle 8) wurde leicht modifiziert für die Walproben dieser Arbeit \·erwendet. in denen maximal 6 Klassen erwartet werden ( 1\.awai et al.. 1988. llenderson et al.. 1994 ).

2.4.2 Durchführung der Analysen Instrumentelle Bedingungen

Das Iatroscan wurde mit einer Wasserstoffflußrate von 173 ml/min und einer Luftflußrate von 2 1/min betrieben. Die Scan Rate der Chromarods betrug 30 s/scan. Die Scanrichtung des lairoseans und die Fließrichtung der Stäbchen waren gegenläufig. Die Datenaufnahme und Peak-integration erfolgten mit dem Programm T DataScan auf einem PC.

Reinigung der Chromarods

Nach jedem Gebrauch \\Urden die Stäbchen aus dem Rahmen genommen, I hin konz. Salpeter-säure gereinigt, mit suprapurem Wasser gespült und mindestens 10 min in suprapures Wasser getaucht. Anschließend wurden die Chromarods wieder in den Rahmen eingesetzt, mit Aceton gespült und im Exsikkator gelagert. Vor dem Auftragen der Proben wurde zuerst ein blankscan ohne Datenaufnahme, dann ein blankscan mit Datenaufnahme aufgenommen, um die Sauberkeit der Chromarods zu überprüfen.

Auftragen der Proben

Das Auftragen der Proben erfolgte mit Hilfe eines speziellen Spottcrs (DC-Auftragegerät PS 0 I der Firma SES). In dieses Gerät \\Urde eine 2 ).li-Spritze fixiert, die exakt über den Chromarods positioniert werden konnte, und deren Inhalt mit konstanter Geschwindigkeit auf die Stäbchen aufgetragen wurde. Die Verwendung des Spottcrs hat im Vergleich zur manuellen Auftragung den Vorteil, die Probenauftragungen exakter und mit besserer Reproduzierbarkeil des Startpunktes durchzuführen. Pro Rahmen wurde jeweils ein Blindwert der Iatroscan-Prozedur, ein Standard (2 ).lg pro Komponente) und jeweils Doppelproben der Organextrakte (ca. 2-4 ).lg Lipid) analysiert. Nach dem Auftragen wurden die Rahmen 2 min auf eine beheizte Platte (60 °C) gelegt, um Lösungsmittelreste zu verdampfen, und anschließend in einer Feuchtigkeitskammer (CaC1₂ -Lösung) konditioniert.

Entwicklungen und partielle Scans

Mit 4 verschiedenen Lösungsmittelsystemen sind 3 Chromatogramme pro Stäbchen aufgenom-men worden. Die Entwicklungskammern wurden jeweils mit ca. 50 ml Flüssigkeit gefüllt.

Zwischen den einzelnen Entwicklungen und zusätzlich vor dem Abbrennen wurden die Rahmen jeweils 5 min luftgetrocknet In dem ersten Lösungsmittelsystem

(Hexan-Diethylether-Ameisen-säure 89: 1:0.06) erfolgte eine doppelte Entwicklung (zuerst 25 min und dann 20 min) mit anschließendem partiellen Abbrennen der Stäbchen bis nach dem Keton-Peak, d. h. bis auf2.8 cm vor dem Auftragungspunkt. In diesem Chromatogramm \\urden die aliphatischen

Kohlenwasser-~laterial und :-.tethoden

stoffe (HC). Wachsester (\VE) und Ketone (KET) voneinander getrennt. Nach erneuter 5 min.

Konditionierung in der Feuchtigkeitskammer folgte eine 35 min. Entwicklung in dem 2.

Lösungsmittelgemisch (Hexan-Diethylether-Ameisensäure 80:20:0.12). Durch Scannen bis auf 1.2 cm \\Urde das 2. Chromatogramm mit der Trennung der Triglyceride (TG), freien Fettsäuren (FFA). aliphatischen Alkoholen (ALC) und Cholesterol (ST) erhalten. Das 3. Chromatogramm mit den sogenannten Aceton-mobilen Polarlipiden und der Gruppe der Phospholipide wurde nach erneuter Konditionierung, doppelter Entwicklung in 100% Aceton (14 und 13 min) und doppelter Entwicklung im 4. Lösungsmittelgemisch (Dichlormethan-Methanol-Wasser 50:40: I 0) durch komplettes Abbrennen der Stäbchen erhalten.

2.4.3 IdentifiZierung und Auswertung

Die Identifizierung der Substanzklassen erfolgte über die relativen RT mit Hilfe eines Standard-gemisches (Tabelle 8 und Abb. 21 ).

Tabelle 8: Zusammensetzung des Lipdstandards

Klasse Abkürzung Subslanz

Aliphatische Kohlenwasserstoffe Wachsester

Ketone Triglyceride Freie Fettsäuren Aliphatische Alkohole Freie Steroie

1-C n·Nonadecan

\fE Octadecylhexadecanoat KET Hexadecan-3·on

TG Glyceryltrihexadecanoat FFA Palmitinsäure

ALC Hexadecan·1-ol ST Choleslerol Aceton-mobile Polarlipide

Phospholipide

AMPL Glyceryl·1-monohexadecanoat PL Phospatidylcholin

Scan I Scan 2 Scan 3

ST PL

WE

HC AMPL

TG

\

Scanrichnmg _., Laufrichtung

-Abb. 21: TLC-FID-Chromatogramme des Lipidstandards (Scan 1-3), Abkürzungen s. Tabelle 8.

Die Zusammensetzung des Standards wurde so gewählt, daß die in den Proben vorkommenden Hauptsubstanzen oder strukturähnliche Vertreter enthalten waren. Exakte absolute RT können bei dieser Art der Chromatographie nicht erwartet werden. Die Konzentrationen des Standards

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42 ^~ Iaierial und ~ Iethoden

betrugen I J.lg/J.il pro Komponente. Die Verdünnungen der Proben \\Urden so gewählt, daß d!~

Probenkonzentrationen in diesem Bereich lagen. Der Linearitätsbereich der Methode \\urd~

zusätzlich mit Verdünnungsreihen überprüft. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe der Peak-flächen und dem aus dem Standard ermittelten Responsefaktor. Aus den Jatroscan-Daten \\urde die relative Lipidzusammensetzung berechnet, die auf die gravimetrisch ermittelten Gesamtlipid-gehalte bezogen worden ist.