3. ERGEBNISSE
3.1 Ergebnisse der ersten Versuchsreihe (DNA-Ad)
3.1.5 Durchflusszytometrische Untersuchungen der zirkulierenden
3.1.5.1 Bestimmung des prozentualen Anteils der CD4 + T-Lymphozyten
Der Vergleich des prozentualen Anteils der CD4+ T-Zellen an den CD3+ T-Lymphozyten (Abb. 3.5 A) ergab in der akuten Phase der Belastungsinfektion eine Reduktion in allen drei Versuchsgruppen. Die Abnahme in den Kontrolltieren war bis zur Woche 8 deutlich stärker ausgeprägt. Zu diesem Zeitpunkt bestand ein signifikanter Unterschied zu den beiden Impfgruppen (Abb. 3.5 B).
Im weiteren Verlauf der Infektion ließen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Versuchsgruppen nachweisen.
A) B)
0 10 20 30 40 50 60 70 20
40 60 80 100
Kontrollen Gruppe 2 Gruppe 3 Wochen nach Belastungsinfektion CD4+ (% der CD3+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
Kontrollen Grp 2 Grp 3 20
40 60 80 100
** **
CD4+ (% der CD3+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
Abb. 3.5: Anteil der CD4+ T-Lymphozyten an den Gesamtlymphozyten nach Belastungsinfektion
Teil A zeigt die Veränderungen des prozentualen Anteils der CD4+ T-Lymphozyten an den CD3+ T-Lymphozyten im Zeitverlauf des Experiments in den drei Versuchsgruppen. Die Linien geben den Median der jeweiligen Gruppe wieder, die Fehlerbalken zeigen den Interquartilabstand I50.
Teil B zeigt die Einzelwerte der prozentualen Anteile der CD4+ T-Lymphozyten an den CD3+ T-Lymphozyten im Blut der Kontrolltiere (∎) und den Tieren der Gruppen 2 (▲) und 3 (▼) in der Woche 8 nach Belastungsinfektion.
Die Querstriche geben den Median der jeweiligen Gruppe an. Mit den Querbalken und Sternen sind signifikante Unterschiede nach dem Mann-Whitney-Test zwischen den Gruppen gekennzeichnet (** p <0,01).
Primäre Zielzellen von HIV und SIV sind die CD4+ T-Lymphozyten. Zur Bindung an die Zelloberfläche benötigt das Virus den Korezeptor CD195 (Bleul et al., 1997). Daher werden während der HIV- bzw. SIV-Infektion zunächst die CD4+195+ T-Lymphozyten infiziert (Mattapallil et al., 2005; Nishimura et al., 2004; Picker et al., 2004).
Um zu überprüfen, ob die Vakzinierung einen Einfluss auf den Verlust dieser Population hat, wurde zusätzlich die Expression des CD195-Oberflächenantigens gemessen.
Die Kontrollen wiesen bereits zwei Wochen nach der Belastungsinfektion mit SIVmac239 eine signifikante Reduktion der CD4+195+ Zellpopulation auf (Abb. 3.6 A). Im Gegensatz dazu nahm der Anteil der CD4+195+ T-Lymphozyten in den beiden Impfgruppen nach Infektion deutlich zu (Abb. 3.6 B). Vier Wochen nach Belastungsinfektion war der Anteil der CD4+195+ T-Lymphozyten in den Kontrolltieren weiterhin deutlich reduziert und im Vergleich zu den Impfgruppen lag jeweils ein hochsignifikanter Unterschied vor (Abb. 3.6 C). Im weiteren Verlauf des Experiments gab es keine weiteren signifikanten Unterschiede.
Ergebnisse A)
0 10 20 30 40 50 60 70 0
100 200
Kontrollen Gruppe 2 Gruppe 3 300
600
Wochen nach Belastungsinfektion CD195+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
B) C)
Abb. 3.6: Anteil der CD195+ T-Lymphozyten an den CD4+ T-Lymphozyten nach Belastungsinfektion
Teil A zeigt die Veränderungen des prozentualen Anteils der CD4+195+ T-Lymphozyten im Zeitverlauf des Experiments in den drei Versuchsgruppen. Die Linien geben den Median der jeweiligen Gruppe wieder, die Fehlerbalken zeigen den Interquartilabstand I50.
Die Teile B und C zeigen die Einzelwerte der prozentualen Anteile der CD4+195+ T-Lymphozyten an den CD4+ T-Lymphozyten im Blut der Kontrolltiere (∎) und den Tieren der Gruppen 2 (▲) und 3 (▼) in den Wochen 2 (B) und 4 (C) nach Belastungsinfektion.
Die Querstriche geben den Median der jeweiligen Gruppe an. Mit den Querbalken und Sternen sind signifikante Unterschiede nach dem Mann-Whitney-Test zwischen den Gruppen gekennzeichnet (* p <0,05; ** p <0,01).
Korrelation der Expression von CD195 auf den CD4+ T-Zellen mit der Virusbeladung
Die Virusbeladung in der Woche 2 wies eine signifikant negative Korrelation zur Expression von CD195 in der Woche 4 auf (Abb. 3.7 A; p = 0,0063;
r = -0,618). Zusätzlich korrelierte die Virusbeladung der Woche 4 invers mit der Expression von CD195 in den Wochen 2 und 4 (Abb. 3.7 B und C; p = 0,013;
r = -0,558 und p = 0,0001; r = -0,787).
Kontrollen Grp 2 Grp 3 0
50 100 150 200 250
300 *
CD195+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
Kontrollen Grp 2 Grp 3 0
50 100 150 200 250
300 ** **
CD195+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
A)
3 4 5 6 7 8
0 50 100 150 200 250
300 p= 0,0063
r= -0,618
log Plasma-RNA (Woche 2) CD195+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
B) C)
3 4 5 6 7 8
0 50 100 150 200 250
300 p= 0,013
r= -0,588
log Plasma-RNA (Woche 4) CD195+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
3 4 5 6 7 8
0 50 100 150 200 250
300 p= 0,0001
r= -0,787
log Plasma-RNA (Woche 4) CD195+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
Abb. 3.7: Korrelation der Plasma-RNA mit der Expression von CD195 auf den CD4+ T-Lymphozyten
Teil A zeigt die Korrelation der Plasma-RNA der Woche 2 mit der CD195-Expression der Woche 2. Die Teile B und C zeigen die Korrelation der Plasma-RNA der Woche 4 mit der CD195-Expression der Woche 2 und 4.
Mit r ist der Spearman-Korrelationskoeffizient und mit p das Signifikanzniveau angegeben.
Die Expression des zur TNF-Rezeptor-Familie gehörenden Oberflächenantigens CD95 wird in vielen Studien mit einem Gedächtnisphänotyp von T-Lymphozyten assoziiert (Pitcher et al, 2002). Ein Erhalt dieser Gedächtniszellen korreliert mit längerem Überleben der Versuchstiere (Kawada et al., 2007). Daher wurde in der polychromatischen Färbung von Blutlymphozyten auch die Veränderung der CD95-Expression auf den T-Lymphozyten untersucht. Es zeigte sich, dass die Kontrolltiere bereits zwei Wochen nach Belastungsinfektion eine signifikante Reduktion der CD4+95+ Zellpopulation im Vergleich zu den Impflingen aufwiesen (Abb. 3.8 A und B). Im weiteren Verlauf der Infektion ließen sich jedoch keine weiteren signifikanten Unterschiede zwischen den Kontrollen und den Impflingen nachweisen.
Ergebnisse
A) B)
Abb. 3.8: Anteil der CD95+ T-Lymphozyten an den CD4+ T-Lymphozyten nach Belastungsinfektion
Teil A zeigt die Veränderungen des prozentualen Anteils der CD4+95+ T-Lymphozyten im Zeitverlauf des Experiments in den drei Versuchsgruppen. Die Linien geben den Median der jeweiligen Gruppe wieder, die Fehlerbalken zeigen den Interquartilabstand I50.
Teil B zeigt die Einzelwerte der prozentualen Anteile der CD4+195+ T-Lymphozyten an den CD4+ T-Lymphozyten im Blut der Kontrolltiere (∎) und den Tieren der Gruppen 2 (▲) und 3 (▼) in der Woche 2 nach Belastungsinfektion.
Die Querstriche geben den Median der jeweiligen Gruppe an. Mit den Querbalken und Sternen sind signifikante Unterschiede nach dem Mann-Whitney-Test zwischen den Gruppen gekennzeichnet (* p <0,05; ** p <0,01).
Korrelation der Expression von CD95 auf den CD4+ T-Zellen mit der Virusbeladung
Die Virusbeladung der Woche 2 korrelierte invers mit der Expression von CD95 auf den CD4+ T-Zellen in den Wochen 2 und 4 nach Belastungsinfektion (Abb. 3.9 A und B; p=0,006; r= -0,620 und p=0,0249; r= -0,526). Weitere Korrelationen konnten für die CD4+95+ Zellpopulation nicht nachgewiesen werden.
log Plasma-RNA (Woche 2) CD95+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
4 5 6 7 8
log Plasma-RNA (Woche 2) CD95+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
Abb. 3.9: Korrelation der Plasma-RNA mit der Expression von CD95 auf den CD4+ T-Lymphozyten
Die Abbildung zeigt die Korrelation der Plasma-RNA der Woche 2 mit der CD95-Expression der Woche 2 (A) und der Woche 4 (B).
Mit r ist der Spearman-Korrelationskoeffizient und mit p das Signifikanzniveau angegeben.
0 10 20 30 40 50 60 70
Kontrollen Gruppe 2 Gruppe 3 Wochen nach Belastungsinfektion
CD95+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte) **
Kontrollen
CD95+ (% der CD4+ T-Zellen, normalisiert auf Präwerte)
Grp 3
3.1.5.2 Veränderungen der CD4+ Gedächtniszellsubtypen nach Infektion