Untersuchung der Bindung von anti-Etmic2-scFv an Sporozoiten durch einen

Mit dem indirekten Immunfluoreszenztest (IFAT) kann die Bindung von Antikörpern an Zellen untersucht werden. Durch die Verwendung eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorophor) gekoppelten Nachweisantikörpers kann die Bindung mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Auf diese Weise können nicht nur Informationen über das Vorhandensein eines Antigens, sondern auch über seine Verteilung auf der Zelle gewonnen werden. Wie bei anderen Methoden, z.B. ELISA, war es auch hier wichtig, entsprechende Negativkontrollen mitzuführen, um Effekte, die durch unspezifische Bindungen des Nachweisantikörpers oder durch Eigenfluoreszenz enstehen, abschätzen zu können. Dafür wurde im Testansatz nur mit den Nachweisantikörpern inkubiert.

Für den IFAT wurden durch IMAC gereinigte Präparationen von sechs verschiedenen anti-Etmic2-scFv verwendet. Zunächst erfolgte die Immobilisierung von Sporozoiten durch Antrocknen einer Suspension auf einem Glasobjektträger. Wie Vorversuche zeigten, konnte auf diese Weise ein größerer Anteil der eingesetzten Sporozoiten auf den Objektträger aufgebracht werden als durch Verwendung einer Zytozentrifuge. Die Immobilisierungs-methode, eine 30minütige Fixierung mit Paraformaldehyd oder eine 15minütige Inkubation mit Methanol zur Permeabilisierung der Zellen beeinflußten die Ergebnisse der Immun-markierung nicht. Nach der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit 5 % BSA wurden die immobilisierten Sporozoiten über Nacht mit den scFv bzw. mit dem anti-rEtmic2-Serum inkubiert. Dazu wurden mindestens 11 ng/µl scFv bzw. eine 1:200-Verdünnung des Serums eingesetzt. Der Nachweis der Antikörperfragmente erfolgte mit einem anti-penta-His-IgG-AlexaFluor^®488-Konjugat. Das anti-rEtmic2-Serum wurde mit einem anti-Maus-IgG-FITC-Konjugat nachgewiesen. Bei einer Blauanregung (470-490 nm) wurden die Fluorophore der beiden Nachweisantikörper mit einer grünen Emission im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.

Negativkontrolle Nachweis mit anti-rEtmic2-Serum

2 µm

2 µm 2 µm

2 µm

2 µm

2 µm

2 µm

2 µm

Negativkontrolle Nachweis mit anti-rEtmic2-Serum

2 µm

2 µm 2 µm

2 µm

2 µm

2 µm

2 µm

2 µm

Abb. 30: Untersuchung der Bindung von anti-Etmic2-scFv und anti-rEtmic2-Serum an immobilisierte Sporozoiten durch IFAT. Die Sporozoiten wurden auf einen Glasobjektträger aufgebracht und mit den Antikörpern inkubiert. Der Nachweis erfolgte durch einen sekundären Antikörper, welcher mit einem Fluorophor gekoppelt ist. Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von jeweils vier mit anti-rEtmic2-Serum bzw. nur dem Nachweisantikörper (Negativkontrolle) inkubierten Sporozoiten. Die anti-Etmic2-scFv zeigten dasselbe Bild wie die Negativkontrolle. Zellbegrenzung und refraktiler Körper sind bei je einem Beispiel zur besseren Verdeutlichung rot hervorgehoben. Die Sporozoiten weisen eine starke Eigenfluoreszenz im Bereich der refraktilen Körper auf (siehe Pfeile). Bei den mit anti-rEtmic2-Serum inkubierten Sporozoiten kommt eine stärkere Fluoreszenzmarkierung dazu, die sich in Flecken über die gesamten Zelle erstreckt. Dadurch erscheint die Eigenfluoreszenz der refraktilen Körper schwächer als bei der Negativkontrolle. Um einen Eindruck von den tatsächlichen Fluoreszenzintensitäten zu bekommen, muß man sich deshalb die Helligkeiten der refraktilen Körper als gleich vorstellen.

Wie Abb. 30 zeigt, weisen die Sporozoiten bei dieser Wellenlänge, v.a. im Bereich der beiden refraktilen Körper, eine deutliche Eigenfluoreszenz auf. Bei den mit dem anti-rEtmic2-Serum markierten Sporozoiten war darüber hinaus eine fleckige Fluoreszenzmarkierung des gesamten Sporozoiten zu erkennen. Diese fehlte jedoch bei den mit den scFv inkubierten Sporozoiten, welche damit dasselbe Bild wie die Negativkontrollen mit anti-penta-His-IgG-AlexaFluor^®488- bzw. anti-Maus-IgG-FITC-Konjugat zeigten.

Auch durch den IFAT mit immobilisierten Sporozoiten ließ sich keine Bindung von anti-Etmic2-scFv nachweisen. Durch das anti-rEtmic2-Serum konnte jedoch eine Fluoreszenzmarkierung der Sporozoiten erhalten werden - ein weiterer Hinweis darauf, daß dieses Serum an natives Etmic2 bindet (vgl. 4.3.1).

4.3.4 Vergleich der Epitope von anti-Etmic2-scFv und Serumantikörpern gegen natives Etmic2 durch einen kompetitiven ELISA

Eine Bindung von anti-Etmic2-scFv an natives Etmic2 bzw. an Sporozoiten ließ sich weder durch einen ELISA oder einen Immunoblot mit Proteinextrakten von E.tenella, noch durch einen Zellanheftungstest oder einen IFAT nachweisen. Ein Grund hierfür kann eine sehr geringe Affinität der Antikörperfragmente sein. Bereits die Biacore-Untersuchungen wiesen darauf hin, daß die Affinitäten der scFv relativ niedrig sind (vgl. 4.2.2). Dies konnte exemplarisch für AH5, AH6, AH11 und AH17 durch einen kompetitiven ELISA mit gelöstem Etmic2 bestätigt werden (vgl. 4.2.3). Ein anderer Grund dafür, daß sich die Bindung von scFv an natives Etmic2 mit den verwendeten Methoden nicht nachweisen ließ, kann ihre Spezifität sein. Möglicherweise erkennen die anti-Etmic2-scFv Epitope, welche auf dem rekombinanten Etmic2-His, nicht aber auf dem nativen Etmic2 vorhanden sind. Dies sollte durch einen kompetitiven ELISA mit anti-nEtmic2-Serum geklärt werden. Dieses Serum wurde von Dr.

Fiona Tomley (IAH, Compton, UK) zur Verfügung gestellt. Es stammt aus Kaninchen, welche mit aus Mikronemen gereinigtem Etmic2 immunisiert wurden [Tomley et al., 1996].

Das anti-nEtmic2-Serum enthält also Antikörper, welche gegen Epitope auf dem nativen Etmic2 gerichtet sind. Epitope, die nur auf dem rekombinanten Etmic2-His, nicht aber auf dem nativen Etmic2 vorhanden sind, sollten von ihnen nicht erkannt werden. Die Bindung der Antikörperfragmente an solche Epitope des Etmic2-His wird demzufolge durch die Zugabe von anti-nEtmic2-Serum nicht beeinflußt. Falls ein scFv jedoch an ein Epitop bindet, das auch auf dem nativen Etmic2 vorhanden ist, kann das anti-nEtmic2-Serum eine kompetitive Hemmung dieser Bindung bewirken, wenn es die entsprechenden Antikörper enthält.

Um dies zu testen, wurde ein kompetitiver ELISA durchgeführt, dessen Prinzip in Abb. 31 dargestellt ist.

MaxiSorpTM - Mikrotiterplatte

Etmic2-His

phagengebundener AH

POD POD POD anti-M13-IgG-POD-Konjugat

TMB-Substratreaktion +H₂SO₄

Kompetition

Nachweis

Antikörper des

anti-nEtmic2-Serums

Abb. 31: Prinzip des kompetitiven ELISA zum Vergleich der Epitope verschiedener anti-Etmic2-scFv (AH) und der Antikörper des anti-nEtmic2-Serums. Die phagengebundenen AH binden an das immobilisierte Etmic2-His. Eine kompetitive Hemmung dieser Bindung durch das anti-nEtmic2-Serum findet nur statt, wenn das durch den AH erkannte Epitop auch von Serumantikörpern erkannt wird, also auch auf nativem Etmic2 vorkommt.

In den Kavitäten einer MaxiSorp^TM-Mikrotiterplatte immobilisiertes Etmic2 wurde dabei mit einem phagengebundenen anti-Etmic2-scFv bzw. dem scFv und anti-nEtmic2-Serum inkubiert. Der Nachweis der Phagen erfolgte durch ein anti-M13-IgG-POD-Konjugat und eine Farbreaktion mit TMB. In Vorversuchen waren die Sättigungsbereiche des immobilisierten Etmic2-His bzw. der phagengebundenen scFv bestimmt worden (Daten nicht gezeigt). Für den eigentlichen Test wurden im linearen Bereich der Sättigungskurve liegende Mengen eingesetzt. Die Bindung von anti-nEtmic2-Serum an immobilisiertes Etmic2-His wurde mit einem ELISA getestet und konnte noch bei einer Verdünnung von 1:15.000 nachgewiesen werden (siehe Abb. 32). Die Untersuchung einer Verdünnung von 1:1.000 lag bereits außerhalb des linearen Bereiches der Nachweismethode.

Für den kompetitiven ELISA wurde das anti-nEtmic2-Serum 1:900 verdünnt, trotzdem konnte keine hemmende Wirkung auf die Bindung von phagengebundenen scFv an rekombinantes Etmic2-His beobachtet werden (siehe Abb. 33).