Bestimmung des aktiven Plasmarenin

Zunächst wurde untersucht, ob sich der aktive Plasmareninspiegel in normotensiven REN1-, REN1/REN2- bzw. REN2-Tiere aufgrund der vorhandenen genetisch bedingten Reninisoformen unterscheidet.

.

Die Versuchstiere (jeweils n=3) wurden unter Narkose mit der Guillotine dekapitiert und das Blut gesammelt. Die Proben wurden nach Standard Protokoll (Material und Methoden (2.8.3.) für die Bestimmung der Reninkonzentration im Plasma aufbereitet und anschließend vermessen. Bei der Bestimmung der Reninkonzentration handelt es sich um die Bestimmung der Reninaktivität in Anwesenheit eines Überschusses an Reninsubstrat.

54 REN1

REN 1/REN

2

REN2 0

10 20 3030 90 150

*

*

Plasmareninkonzentration in % zu REN1- Mäusen

Abbildung 3-1: Plasmareninkonzentration bei homozygoten REN1-, heterozygoten REN1/REN2 und homozygoten REN2 Tieren

Die Experimente zeigten, dass im Plasma (Abb. 3-1) Unterschiede bezüglich der aktiven Renin Konzentration festgestellt werden konnten. Diese war bei den REN2- Tieren um den Faktor 5,3 gegenüber den REN1 -Kontrolltieren und um einen Faktor 4,7 gegenüber den REN1/REN2- Mäusen erniedrigt. Daraus ergab sich die Frage, ob die erniedrigte aktive Plasmareninkonzentration eine Folge verminderter Renin mRNA Abundanz ist oder -ausgehend von der Hypothese, dass eine Umsetzung der mRNA in Protein unbeeinflusst ist- eine verminderte renale Aktivierung und Ausschleusung des Renin2 aufgrund der fehlenden Glykosylierung in den REN2- Tieren der Fall sein könnte.

55 1.2 Quantifizierung der Renin1 bzw. Renin2 mRNA der Niere

Die Reningenexpression der REN1-, REN1/REN2- bzw. REN2-Tiere wurde mittels eines RNAse Protection Assays überprüft.

Dazu wurden die Tiere zunächst mit Isofluran leicht narkotisiert und durch Genickbruch getötet, die Nieren frei präpariert und entnommen. Anschließend die Gesamt- RNA nach Standard-Protokoll wie in Material und Methoden 2.3.3.4 und 2.4.

beschrieben isoliert und quantifiziert. Die Quantifizierung der Expression erfolgte dabei mittels radiometrischer Messungen.

Wie deutlich in Abb. 3-2 A zu erkennen ist, exprimieren die homozygoten REN1-Tiere, ausschließlich Renin1 mRNA und die homozygoten REN2-Tiere ausschließlich Renin2 mRNA. Während die heterozygoten REN1/REN2 Tiere im RNAse Protection Assay sowohl ein positives Signal für Renin1 als auch für Renin2 mRNA zeigen.

56

Renin mRNA/ ß-Aktin mRNA [cpm/µg//cpm/µg]

Abbildung 3-2: Expression der Gesamt Renin mRNA in REN1-, REN1/REN2- und REN2- Tieren

A Autoradiographie des RNAse Protection Assays unter der Verwendung einer Antisense Probe, die eine Unterscheidung der Renin Isoformen Ren1 /Ren2 ermöglicht.

B Quantifizierung des Hybridisierungsignals. Die Werte geben das Verhältnis der Hybridisierungssignale von Renin- und ß-Aktin mRNA derselben Proben wieder. Die Werte sind Mittelwerte +/- SEM aus jeweils 3 Messungen. Die Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p<

0,05.

57 Die Quantifizierung (Abb. 3-2 B) zeigte eine 3-fach höhere Expression der Renin2 mRNA im homozygoten REN2- Tier gegenüber der Renin1 mRNA im homozygoten REN1- bzw. der Gesamt- Renin mRNA im heterozygoten REN1/REN2- Tier.

Bei den heterozygoten Mäusen lässt sich zudem festhalten, dass die Gesamt- Renin mRNA Abundanz vergleichbar mit der der REN1- Tiere ist.

Renin 1

Renin 2

Renin gesamt 0.000

0.025 0.050 0.075

Renin1 mRNA bzw. 2/ ß-Aktin mRNA [cpm/µg//cpm/µg]

Abbildung 3-3: Expression der Renin mRNA Isoformen in REN1/REN2 Tieren Quantifizierung des Hybridisierungsignals. Die Werte geben das Verhältnis der Hybridisierungssignale von Renin- und ß-Aktin mRNA derselben Proben wieder. Die Werte sind Mittelwerte +/- SEM aus jeweils 3 Messungen.

Die Quantifizierung der Reninisoformen Ren1 und Ren2 der heterozygoten Tiere zeigte, dass zu 3/5 Ren1 mRNA und zu 2/5 Ren2 mRNA intrarenal exprimiert wird.

58 1.3 Weitere in vivo Befunde

Die vorausgegangenen Experimente zeigen, dass die in den C57/BL6 Hintergrund rück gekreuzten REN1-Tiere ausschließlich Renin1 mRNA und die REN2-Tiere ausschließlich Renin2 mRNA exprimieren, wobei die Expression der Ren2 mRNA gegenüber der Ren1 mRNA Abundanz um den Faktor 3 erhöht ist. Auf Proteinebene kehrt sich dieses Phänomen um. Mittels eines AngI- RIAs ließ sich zeigen, dass der aktive Reningehalt des Plasmas der REN1/REN2- und REN2-Tieren gegenläufig zu den erhobenen mRNA Daten sind.

Die Daten bekräftigen die Vermutung, dass vorangehende Prozessierungsschritte des Renins in REN1-, REN1/REN2- und REN2- Tieren auf unterschiedliche Weise erfolgen. Um dies zu überprüfen wurde mit heterozygoten REN1/REN2- und homozygoten REN2- Tieren klassische Manöver durchgeführt um eine Stimulation der Reninsekretion in vivo zu erreichen. Damit sollte überprüft werden, ob der unterschiedliche Glykosylierungszustand der Reninisoformen sich nachweisbar auf die regulierte Freisetzung, ausgelöst durch die Behandlung der Versuchstiere mit ACE- Hemmer und Niedrigsalz- Diät, auswirkt.

1.3.1 Chronische Stimulation des RAAS

Heterozygote REN1/REN2- Tiere und homozygoten REN2- Tieren (n=3) wurden 7 Tagen lang unter salzarmer Kost (0,02% NaCl) in Kombination mit Ramipril [100mg/L]- haltigem Wasser gehalten, um eine chronische und effektive Stimulation des RAAS zu erzielen.

Nach Ablauf des Versuches wurde die Tiere unter Narkose dakapitiert, das Blut gesammelt und anschließend die Nieren frei präpariert. Die Proben wurden jeweils nach Standard-Protokoll (Material und Methoden 2.8.3. & 2.4.) aufgearbeitet und mittels AngI- RIA bzw. RNAse Protection Assays die Reninkonzentration bestimmt (Abb. 3-4) und die Renin mRNA Abundanz (Abb.3-5) quantifiziert.

59 REN1/REN2 Ba

sal

REN1/REN2 Ramipril/Low S alt

REN2 Basal

REN2 Ramipril/Low Salt 0

35 70

*

150 650 1150 1650 2150

*

Plasmareninkonzentration [ng* AngI / h*ml]

Abbildung 3-4: Aktiver Reningehalt des Plasmas bei REN1/REN2 und REN2 – Tieren unter Kontrollbedingungen und nach einer 7-tägigen Niedrigsalzdiät (0,02% NaCl) und Gabe von Ramipril [100mg/L] haltigem Wasser.

Die Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SEM von jeweils 3 Messungen.

Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05.

Bei den homozygot ausschließlich Renin2 mRNA exprimierenden REN2- Tieren, war, wie in Abbildung 3-4 zu sehen, ein 24- fachen Anstieg der aktiven Reninkonzentration im Plasma gegenüber der Kontrollgruppe messbar. Während die REN1/REN2- Tiere auf die chronische Stimulation des RAAS vergleichbar mit einem 27- fachen Anstieg der aktiven Reninkonzentration gegenüber der Kontrollgruppe reagierten.

60 Jedoch zeigten die REN1/REN2- Tiere auch hier bereits basal eine 5-fach höhere aktive Reninkonzentration im Plasma als die REN2- Tiere.

Parallel dazu wurde die Renin1- und Renin2- mRNA Expression mit Hilfe eines RNAse Protection Assays bestimmt.

REN1/REN 2 Basal

REN1/REN2Ramipril/Low Salt

REN2 Basal

REN2 Ramipril/Lo w Sa

lt 0.0

0.1 0.2 0.3

0.4

* *

Renin Gesamt mRNA/ ß-Aktin mRNA [cpm/µg//cpm/µg]

Abbildung 3-5a: Expression der Gesamt- Renin mRNA in REN1/REN2- und REN2- Tieren

Quantifizierung des Hybridisierungsignals. Die Werte geben das Verhältnis der Hybridisierungssignale von Renin- und ß-Aktin mRNA derselben Proben wieder. Die Werte sind Mittelwerte +/- SEM aus jeweils 3 Messungen. Die Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p<

0,05.

Die Analyse der Renin mRNA in der Niere zeigte bei den heterozygoten Tieren einen Anstieg der Gesamt- Renin mRNA Abundanz (Ren1 und Ren2 mRNA) um den

61 Faktor 4. Des Weiteren konnte ebenfalls eine Erhöhung der Renin2 mRNA Abundanz um den Faktor 2,6 bei den homozygoten REN2 Tieren gezeigt werden. Die basale Reninabundanz war in diesen Versuchen bei den homozygoten REN2- Tieren um einen Faktor 1,5 gegenüber den heterozygoten REN1/REN2- Tieren erhöht.

Ren1 B

Renin1 bzw. 2 mRNA/ ß-Aktin mRNA [cpm/µg//cpm/µg]

Abbildung 3-5b: Expression der Renin mRNA Isoformen in REN1/REN2- Tieren Quantifizierung des Hybridisierungsignals. Die Werte geben das Verhältnis der Hybridisierungssignale von Renin- und ß-Aktin mRNA derselben Proben wieder. Die Werte sind Mittelwerte +/- SEM aus jeweils 3 Messungen. Die Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p< 0,01 bzw. 0,001.

Die Analyse der einzelnen Reninisoformen in den heterozygoten REN1/REN2- Tieren zeigte, dass sowohl die Abundanz der Ren1 mRNA als auch die der Ren2 mRNA durch die Kombination von Ramipril und einer Niedrigsalz Diät gesteigert werden konnte. Im Falle der Renin1 mRNA um einen Faktor 3,9 und Renin2 mRNA um eine Faktor 4,8.

62 Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die chronische Stimulierbarkeit des RAAS sowohl bei den REN1/2-Tieren als auch bei den REN2- Tieren, durch den Einsatz von ACE- Hemmern in Kombination mit einer Niedrigsalz- Diät, auf transkriptioneller Ebene und auf Proteinebene möglich ist. (Abb.3-5a). Allerdings ist auf Proteinebene das Niveau auf dem diese Regulation stattfindet bei den REN2- Mäusen um einen Faktor 5 niedriger als bei den REN1/REN2- Mäusen. Da die chronische Stimulation des RAAS, über einen Zeitraum von sieben Tagen, sowohl die transkriptionelle als auch die sekretorische Ebene umfasst, wurde im folgenden die Stimulation auf 45 min begrenzt um die Effekte einer gesteigerten Transkription der Renin mRNA als Regulationsantwort zu unterbinden.

1.3.2 Akute Stimulation des RAAS

Für die Messung einer akuten Stimulation des RAAS ist es erforderlich die Tiere bereits im Vorfeld besonders gut an die Versuchsbedingungen zu gewöhnen, um eine unerwünschte Stimulation des Renin- Angiotensin- Aldosteron- Systems durch Stress zu vermeiden. Die Tiere wurden dementsprechend in den Tagen vor Versuchsbeginn trainiert.

Am ersten Versuchstag wurde Blut durch Schwanzbiopsie gewonnen (Ren1:n=5;

Ren1/Ren2:n=3; Ren2:n=5), das Plasma abgetrennt und bei -20°C zunächst gelagert. 8 Tage später wurde den Tieren intraperitoneal Furosemid [30mg/Kg]

appliziert und 45 min nach der Injektion erneut Schwanzblut entnommen und das Plasma gewonnen. Anschließend wurde nach Standardprotokoll der Plasmareningehalt vor und nach dem Stimulationsmanöver mit Hilfe eines AngI RIAs bestimmt (Material und Methoden 2.8.3).

63

Plasmareninkonzentration [ng ANGI / h*ml]

Abb. 3-6: Plasmareninkonzentration vor und 45 min nach akuter Stimulation des RAAS durch i.p. Applikation von Furosemid.

Die Werte sind Mittelwerte +/- SEM aus REN1:n=5; REN1/REN2:n=3;

REN2:n=5 Messungen. Die Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p< 0,01

Wie in Abbildung 3-6 zu erkennen ist konnte bei allen Tieren durch die akute Stimulation eine Erhöhung der Reninkonzentration im Plasma erreicht werden.

Allerdings fiel diese beiden REN1- Tieren mit einem Faktor von 9,8 gegenüber den Heterozygot REN1/REN2 exprimierenden Tieren mit 5,0 und den REN2- Tieren mit einer Steigerung der aktiven Reninkonzentration im Plasma um einen Faktor 4,2 deutlich höher aus.

64 1.4 Reninfreisetzung aus der isoliert perfundierten Niere (ex- vivo)

Die Reninsekretion lässt sich sowohl in den REN1-, die nur Renin1 exprimieren, als auch in den REN2- Mäusen, die nur Renin2 exprimieren, durch physiologische Manöver wie der Hemmung des Angiotensin- Converting- Enzyms oder durch den Einsatz von Schleifendiuretika - wenn auch auf unterschiedlichen Ebenen –steigern.

Interessant war hier vor allem der Befund, dass bei akuter Stimulation die Freisetzung von aktivem Renin bei den REN2-Mäusen wesentlich geringer ausfiel als bei den REN1- bzw. REN1/REN2- Tieren. Dies könnte auf eine gestörte endogene Aktivierung des unglykosylierten Renin2 Proteins in den Zellen hinweisen. Daher wurde im Folgenden untersucht, inwiefern es sich bei diesem Manöver tatsächlich um eine regulierte Freisetzung aktiven Renins aus den juxtaglomerulären Zellen der REN1- bzw. REN2- Tiere handelt oder ob eventuell erst im Plasma der Tiere eine Aktiverung des Renins durch systemische Faktoren statt findet.

Für folgende Untersuchungen wurde das Modell der isoliert perfundierten Niere gewählt. Die Niere wird nach entsprechender Vorbereitung mit einem definierten Puffer perfundiert und der Perfusionsdruck, der einen wesentlichen Kontrollmechanismus der Reninsekretion darstellt, während des gesamten Versuchsablaufes elektronisch konstant gehalten. In Gegensatz zu in vivo Experimenten, kann dementsprechend in der isoliert perfundierten Niere die renale Reninsekretion unter definitivem Ausschluss systemischer Regulationsmechanismen untersucht werden. Daraus folgt, dass die Reninsekretion als direkter Effekt auf das Perfusat und dessen Zusammensetzung, das den arteriellen Blutfluss simuliert, verstanden werden kann. Das venös wieder aus der Niere tretende Perfusat wird gesammelt und anschließend auf Reninaktivität hin untersucht.

Die Nieren der Mäuse wurden wie in Material und Methoden 2.9 beschrieben präpariert. Im laufenden Versuch wurde der Druck jeweils konstant auf 90mmHg gehalten, der venöse Fluss notiert und Proben jeweils in 2 Minuten Abständen entnommen. Die Zusätze des Perfusats unterschieden sich während der verschiedenen Manöver wie folgt. Die Reninkonzentration wurde durch einen AngI

65 RIA bestimmt und anschließend daraus zusammen mit der Flussrate des Perfusats und des jeweiligen Nierengewichtes die Reninsekretionsrate berechnet.

Das Basis Perfusat bestand jeweils aus einer modifizierten Krebs- Henseleit Lösung (Material und Methoden 2.9), ergänzt mit Rinder Albumin (6g/100mlPerfusat) und humanen roten Blutkörperchen (10% Hämatokrit). Die Stocklösungen an Isoproterenol wurden dem jeweils frisch präparierten Perfusat unmittelbar vor Versuchsbeginn zugesetzt. Um die Kalziumkonzentration des Perfusats zu vermindern wurde dem Perfusat der Kalzium- Chelator EGTA (Ethylenglykol-bis(aminoethylether) Tetraessigsäure) 3,1 mMol/L zugesetzt.

Im Folgenden wurde Isoproterenol zur Stimulation der Reninfreisetzung gewählt, das als klassischer Stimulator des RAAS und somit der Reninsekretion etabliert ist.

1.4.1 Effekt von Isoproterenol [10nM] auf die Reninsekretion

Isoproterenol wirkt Rezeptorvermittelt, über ß- Adrenorezeptoren, auf die Adenylatzyklase und führt damit zu einer schnellen Erhöhung des intrazellulären cAMP- Spiegels. Dies wiederum hat eine Erhöhung der Reninfreisetzung zur Folge.

66

Abb. 3-7: Bestimmung der Reninsekretionsrate bei REN1-, REN1/2- und REN2- Tieren nach Gabe von Isoproterenol [10nM].

Die Werte sind Mittelwerte +/- SEM aus REN1:n=7; REN1/REN2:n=3;

REN2:n=5 Messungen. Die Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p< 0,01

Wie in Abbildung 3-7 zu erkennen ist lässt sich bei den REN1- und den REN1/REN2- Tieren eine signifikante Steigerung der Reninsekretionsrate um den Faktor 28 bzw.

26 durch das Isoproterenol Manöver erreichen. Was gut zu den Plasmarenin Daten der chronischen und akuten Stimulations- Experimente passt.

Die Bestimmung der Reninsekretionsrate der REN2 isoliert perfundierten Nieren zeigen jedoch, dass eine Stimulation durch Isoproterenol keine Wirkung auf die Freisetzung aktiven Renins aus der Niere hat. Dies untermauert die anfangs gestellte Hypothese, dass das Renin2 aufgrund der fehlenden Glykosylierung nicht endogen aktiviert wird.

Diese Hypothese soll unter anderem mit dem im folgendem etablierten System geklärt werden können.

67 2 Untersuchung der Reninprozessierung auf zellulärer Ebene (in

vitro)

Die ex- vivo Versuche haben eindeutig gezeigt, dass aktives Renin2, die unglykosylierte Isoform des Renin1 Proteins, nicht durch die bekannten, klassischen Manöver reguliert freigesetzt werden kann. Um die Hypothese, dass dieses Phänomen auf die fehlende Glykosylierung zurückgeführt werden kann, in zukünftigen Versuchen klären zu können, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit ein in- vitro System zu etablieren, mit dessen Hilfe der Ablauf der zellulären Reninprozessierung dargestellt werden kann.

Als Ausgangszellsystem wurde die murine Zelllinie As4.1 gewählt, da es sich hier um immortalisierte, juxtaglomeruläre Zellen handelt, die endogen die glykosylierte Form des Renin exprimiert und dabei unter den bekannten klassischen cAMP und Kalzium Manövern auch entsprechend reagieren. Eine ideale Vorraussetzung für die Etablierung eines in- vitro Systems mit dessen Hilfe die Prozessierung des murinen Renins möglichst nahe an den tatsächlichen in- vivo Abläufen der Niere untersucht werden kann.

Um den Weg des Renins, während der Prozessierung und der Vorbereitung zur Sekretion, in der Zelle sowohl biochemisch als auch optisch in Echtzeit verfolgen zu können sollte das Reninprotein direkt markiert werden. Dabei fiel die Wahl auf das so genannten Enhanced Green Fluorescent Protein, kurz EGFP. Durch das Generieren von entsprechenden Konstrukten sollten in Zellkultur Fusionsproteine translatiert werden, deren Lokalisation dann in der Zelle durch die Detektion des angeregten

EGFProteins möglich wird. .

68 2.1 Konstrukte

Als Grundvektor diente bei allen Renin- EGFP Konstrukten ein CMV getriebenes EGFP Plasmid. Die Generierung der Konstrukte erfolgte durch Klonieren der entsprechenden cDNA Sequenzen in die Multiple Cloning Site des Vektors. Dabei wurden die Schnittstellen so gewählt, dass sich die EGFP Sequenz in frame an den C- Terminus der REN1 Gensequenz anschloss, wodurch gewährleistet wurde, dass bei Expression des Konstruktes ein Fusionsprotein aus Präprorenin und EGFP entsteht.

Da Präprorenin1 bekanntlich drei potentielle Glykosylierungstellen Asn69, Asn139 und Asn320 besitzt, die entscheidend zur Prozessierung des Proteins beitragen können, wurden verschiedene Mutationskonstrukte generiert, durch deren Einsatz die Beteiligung der Stellen alleine oder in Kombination überprüft werden sollen. Die in der Arbeit verwendeten Mutationskonstrukte wurden ausgehend vom Grundkonstrukt pRen1EGFP generiert. Das Einführen von Punktmutationen in die Gensequenzen zielte dabei auf einen gerichteten Aminosäureaustausch. Dadurch konnten die drei potentiellen Glykosylierungsstellen des Ren1EGFP Proteins, alleine oder in Kombination so verändert werden, dass eine ursprüngliche Glykosylierung des Proteins, entsprechend der jeweiligen Mutation, nicht mehr möglich war.

Da nicht nur die Glykosylierung eine große Rolle bei der Prozessierung des Renins spielen kann, sondern auch das Prosegment entscheidend an den Prozessen beteiligt sein kann, wurden, wie im Folgenden beschrieben, weitere Mutationskonstrukte generiert. Es wurden Schnittstellen eingeführt, die in mehren Schritten eine Deletion der Prä- bzw. Prosequenz in den REN1 Gensequenzbereichen der Konstrukte ermöglichte.

69 Für anstehende vergleichende Untersuchungen der Renin1 und Renin2 Prozessierung wurde das Renin2 Gen ebenfalls in einen pEGFP-N1 Grundvektor kloniert. Dies erfolgte im Zuge dieser Arbeit nach dem für pRen1EGFP oben beschriebenen Prinzip und lieferte so ein Fusionsprotein aus Präprorenin2 und EGFP.

2.1.1 Transfektionseffizienz und Fluoreszenzintensität

Um für alle folgenden Experimente eine vergleichbare Expression der generierten Konstrukte gewährleisten zu können, wurde zunächst überprüft, ob primär alle Konstrukte transient in den As4.1 Zellen exprimiert werden und ob es dabei im Bezug auf die Transfektion der jeweiligen Konstrukte in die Zellen Unterschiede in der Effizienz gibt.

Für die optischen Untersuchungen war eine weitere Voraussetzung, dass die Fusionsproteine in ihrer Fluoreszenzintensität keine Unterschiede aufweisen, da nur so vergleichende Studien durchgeführt werden können. Außerdem könnten die eingeführten Mutationen der Konstrukte zu einer abgewandelten Konformation der unterschiedlichen Fusionsproteine führen. Dies würde sich in einer verminderten Fluoreszenzintensität äußern. Daher wurde auch die Intensität der mutierten Fusionsproteine im direkten Vergleich dem Ren1EGFP überprüft.

Für diese Versuche wurden die As4.1- Zellen ausgesät und mit den jeweiligen Konstrukten transfiziert. Nach dem Ernten der Zellen wurden sie für die FACS- Analyse präpariert. Als negative Kontrolle dienten nur mit FuGENE6 inkubierte Zellen, um eine eventuell störende Autofluoreszenz ausschließen zu können. Die Transfektion der Zellen mit dem unveränderten pEGFP-N1 Grundvektor stellte die positive Kontrolle dar.

Die Effizienz der Transfektion der Konstrukte in As4.1 Zellen wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie bei einer Anregungswellenlänge von 488nm ermittelt. Die Werte repräsentieren jeweils die Mittelwerte aus drei Versuchsansätzen und dabei

70 den Anteil der transfizierten Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl der jeweiligen Analyse Ansätze. Die Transfektionseffizienz der pRen1EGFP Konstrukte wurde auf 100% gesetzt und alle anderen Konstrukte anschließend auf Ren1EGFP bezogen.

Ren1

Transfektionseffizienz in % zu Ren1

Abb.3-8 : Transfektionseffizienz der Konstrukte in As4.1 Zellen.

Die Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SEM von jeweils 3 Messungen.

Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 gegenüber pRen1EGFP transfizierter Zellen.

Die Abbildung 3-8 zeigt deutlich, dass die Transfektionseffizienz der einzelnen Plasmide in As4.1 Zellen keinerlei Unterschiede aufweist.

Um Aussagen über die mittlere Fluoreszenzintensität der einzelnen Ansätze treffen zu können wurden alle Zellen, die als transfiziert identifiziert wurden bezüglich ihrer Fluoreszenz quantifiziert und das Ergebnis dann durch die Anzahl der Zellen gemittelt (Abb. 3-9).

71 Die mittlere Fluoreszenzintensität der Ren1 Fusionsproteine mit EGFP in den Zellen wurde auf 100% gesetzt und alle anderen Intensitäten anschließend auf Ren1EGFP bezogen.

Mittlere Fluoreszenzintensität in % zu Ren1

Abb. 3-9: Mittlere Fluoreszenzintensität der transfizierten As4.1 Zellen. Die Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SEM von jeweils 3 Messungen. Die Sterne kennzeichnen Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,001 gegenüber pRen1EGFP (und allen anderen transfizierter Zellen).

Vergleicht man die mittlere Fluoreszenzintensität der pEGFP transfizierten Zellen mit der der pRen1- bzw. pRen2EGFP transfizierten Zellen kann man einen deutlichen Unterschied erkennen. Die Fusionsproteine lagen mit ihrer mittleren Fluoreszenzintensität in allen Versuchen etwa einen Faktor 2,4 unter der mittleren Fluoreszenzintensität des ursprünglichen EGFP Chromophors.

72 Die quantitative Überprüfung der Effizienz der generierten Konstrukte bezüglich ihrer Transfektion in As4.1 Zellen und der Nachweis der mittleren Intensität der in den Zellen lokalisierten EGFP- Fusionsproteine lieferte Ergebnisse, die einen Einsatz in weiter führenden Versuchen ermöglichte.

2.1.2 Biochemischer Nachweis der Fusionsproteine

Eine weitere wichtige Voraussetzung für die Etablierung eines in- vitro Systems war die Möglichkeit die Fusionsproteine auf biochemischer Ebene nachweisen zu können. Wenn durch optische Studien bereits eine veränderte Lokalisation der

Eine weitere wichtige Voraussetzung für die Etablierung eines in- vitro Systems war die Möglichkeit die Fusionsproteine auf biochemischer Ebene nachweisen zu können. Wenn durch optische Studien bereits eine veränderte Lokalisation der

Im Dokument Intrazelluläre Reninprozessierung (Seite 53-96)