Beladung der PEG-Hydrogele mit Proteinen

Bevacizumab (Avastin^®) ist ein monoklonaler, humanisierter Antikörper und besteht aus zwei leichten und zwei schweren Aminosäureketten. Neben den vier N-Termini dieser Ketten sind in dem Molekül noch insgesamt 90 Lysinreste mit primärem aliphatischem Amin in der Seitenkette enthalten, die theoretisch mit dem Succinimidylester des in situ gelierenden PEG-Hydrogels reagieren können [50]. Ob sie tatsächlich reagieren, hängt auch davon ab, wie zugänglich die jeweilige Amingruppe im Protein ist.

Um die Reaktion des Antikörpers mit der Vorstufe des PEG-Hydrogels zu verhindern, sollte Bevacizumab als Feststoff verarbeitet werden. Dazu muss die Löslichkeit des Proteins in Wasser herabgesetzt werden. Mit Hilfe von Polyethylenglykol können Proteine aus Lösungen ausgefällt werden, ohne dass es zu deren Denaturierung kommt [58]. Mit Lösungen verschiedener Polyethylenglykole wurde zunächst versucht, die zur vollständigen Präzipita-tion von Antikörpern aus deren Lösungen erforderliche, minimale PEG-KonzentraPräzipita-tion zu finden. Da Bevacizumab sehr teuer ist, wurden die Versuche mit γ-Globulinen aus bovinem

Blut durchgeführt. Die γ-Globulinfraktion der Plasmaproteine wird von den Immunglobulinen gebildet und enthält neben den IgG-Antikörpern (zu denen Bevacizumab zählt) auch IgA- und IgM-Antikörper [64].

Abb. 54: Ausfällung von γ-Globulinen mit Hilfe von verschiedenen PEG-Lösungen.

Kontrolle (ohne PEG) PEG 400

PEG 2000 PEG 10000

# konnte nicht vermessen werden

In Abb. 54 sind die Ergebnisse der Versuche zusammengefasst, für die eine γ-Globulin-Lösung mit der jeweiligen PEG-γ-Globulin-Lösung so gemischt wurde, dass die entstehende γ-Globulin-Lösung bzw. Suspension 1 mg Protein pro Milliliter enthielt. Dabei wurden PEGs mit verschiedenen Kettenlängen verwendet: PEG 400, PEG 2000 und PEG 10000. Das ausgefällte Protein wurde abzentrifugiert und der klare Überstand UV-spektroskopisch vermessen.

In der Kontrollgruppe (reiner Puffer ohne PEG) blieb erwartungsgemäß die gesamte Proteinmenge in Lösung. Durch das kurzkettige PEG 400 konnten die Antikörper zwar ausgefällt werden, jedoch reichten die untersuchten Konzentrationen nicht zur vollständigen Präzipitation aus. Bis zu einer Konzentration von 30% (m/V) PEG 400 fiel praktisch kein Protein aus, erst ab 40% (m/V) begann die Präzipitation, wobei auch mit der höchsten Konzentration (50% (m/V)) die γ-Globuline nicht vollständig abgetrennt werden konnten.

Von PEG 2000 dagegen reichten schon 30% (m/V) für eine vollständige Präzipitation aus;

mit mehr PEG konnte die in Lösung bleibende Menge Protein nicht mehr verringert werden.

Dabei fällt auf, dass mit 10% (m/V) noch nahezu die gesamte Proteinmenge gelöst blieb.

PEG10000 war am effektivsten, da schon in Gegenwart von nur 10% (m/V) ein Großteil der Proteinmenge (> 60%) ausfiel. Um das Protein quantitativ zu präzipitieren reichten

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0 10 20 30 40 50

γ-Globulin im Überstand (mg/ml)

PEG-Konzentration (%)

#

#

20% (m/V) des langkettigen PEG 10000 aus. Gerade die höher konzentrierten Lösungen von PEG 10000 (ab 40% (m/V)) sind allerdings sehr viskos, so dass sich beim Einfüllen in die Küvette leicht Schlieren bildeten und die betreffenden Lösungen nicht vermessen werden konnten.

In der Literatur wird für die Präzipitation von Proteinen durch PEG ein Verdrängungs-mechanismus beschrieben. Danach belegt gelöstes PEG als inertes Polymer bestimmte Bereiche im Lösungsmittel, aus denen das Protein sterisch ausgeschlossen wird. Folglich konzentriert sich dieses in dem PEG-freien Bereich des Lösungsmittels, bis seine Löslichkeit überschritten wird und es schließlich zur Präzipitation kommt [3]. Die Verringerung der Löslichkeit des Proteins hängt dabei in erster Linie von der Größe des Proteins und der Kettenlänge des Polymers ab [58]. Der Grund für die unterschiedliche Effektivität der hier verwendeten PEGs liegt also in deren verschieden langen Polymerketten: PEG 10000 (die Zahl gibt das mittlere Molekulargewicht an) besteht aus etwa 227 sich wiederholenden Einheiten, während PEG 400 nur neun solcher Einheiten aufweist. Damit hat PEG 400 eine deutlich geringere räumliche Ausdehnung als PEG 10000 und folglich ist die sterische Behinderung der relativ großen Antikörper (ca. 150 kDa) durch PEG 400 weniger effizient [3]. Die Effizienz des PEG 2000 (mit etwa 45 Einheiten) liegt erwartungsgemäß zwischen den beiden anderen Polymeren.

Wegen der geringen Löslichkeit eines Proteins bei seinem isoelektrischen Punkt (IEP) ist zu erwarten, dass auch der pH-Wert bei der Präzipitation von Proteinen durch PEG eine Rolle spielt. Beispielsweise kann Albumin, dessen IEP im Bereich von 4,6-4,7 liegt, bei neutralem pH-Wert nicht vollständig ausgefällt werden [49]. Daher wurde stattdessen die γ-Globulin-fraktion der Plasmaproteine als Modellprotein verwendet. Auch der isoelektrische Punkt des IgG-Antikörpers Bevacizumab (errechnet wurde ein Wert von 8,1 [133] gestattet das voll-ständige Ausfällen des Proteins bei neutralem pH, so dass die Forderung nach pH-neutralen Lösungen zur intraokularen Injektion [29] erfüllt werden kann.

Zur vollständigen Präzipitation der Proteine werden, je nach Kettenlänge, 20-30% (m/V) PEG benötigt. Die Herstellung der PEG-Hydrogele aus den beiden Vorstufen (PEG-Succin-imidyl-Propionat und PEG-Amin, s. Abschnitt 1) erfolgt aber mit insgesamt nur 4% Polymer.

Folglich muss zur Beladung der PEG-Hydrogele mit Antikörpern noch zusätzliches, nicht-quervernetzbares PEG zugefügt werden, das dann in deutlichem Überschuss vorliegt, so dass ein Einfluss auf die Gelierung nicht ausgeschlossen werden kann. Daher wurde die Gelierung der PEG-Hydrogele am oszillierenden Rheometer sowohl in Abwesenheit als auch in

Wie aus Abb. 55 ersichtlich, verkürzt sich die Gelierungsdauer durch Zugabe von nicht-quervernetzbarem PEG auf etwa die Hälfte. Außerdem steigt das Speichermodul G' in Gegen-wart von PEG 2000 nur auf etwa die Hälfte des Werts ohne PEG an. Je höher G' ist, desto elastischer, also desto besser quervernetzt ist das Gel. Der Zusatz von PEG 2000 hat also tatsächlich einen Einfluss auf die Gelierung des PEG-Hydrogels, die entstehenden Gele sind weniger fest als ohne zusätzliches PEG. Des Weiteren könnte auch das präzipitierte Protein einen Einfluss auf die Gelierung haben. Wie die untere Grafik in Abb. 55 zeigt, ist das jedoch nicht der Fall. Der Einfluss des nicht-quervernetzbaren PEGs bleibt bestehen, aber weder die Gelierungsdauer noch das Ausmaß der Quervernetzung ändern sich wesentlich gegenüber dem proteinfreien Gel.

Abb. 55: Rheologische Unteruchungen der Gelierung von in situ gelierenden PEG-Hydrogelen:

a) ohne zusätzliches PEG

b) mit zusätzlichem, nicht-quervernetzbarem PEG

c) mit zusätzlichem, nicht-quervernetzbarem PEG und Bevacizumab (Avastin^®)

■ - Speichermodul (G') ▲ - Verlustmodul (G'') ○ - Phasenverschiebung (δ)