3.1 Versuche am Tiermodell
3.1.2 Behandlungen
Eine Tierversuchsgenehmigung für die nachfolgend beschriebenen Experimente gemäß des § 7 TSchG sowie eine Ausnahmegenehmigung zur Durchführung durch die Promovendin liegen vor.
3.1.2.1 INTRAPERITONEALE INJEKTIONEN
LPS: Den Mäusen wird intraperitoneal (i.p.) 12,5 mg pro kg Körpergewicht LPS injiziert, den Kontrolltieren entsprechende Volumina NaCl. Die Mäuse werden dann nach einer Zeit
von maximal 24 Stunden durch eine ebenfalls intraperitoneale Gabe von Ketamin/Xylazin anästhesiert und nach Organentna
15N-Arginin: Analog zu den LPS Injektionen werden 100 µl
Nach vier Stunden wird unter Isofluran Narkose die Blase punktiert und Urin entnommen, anschließend erfolgt ebenfalls die S
3.1.2.2 IMPLANTATION Zur kontinuierlichen Gabe von ADMA
Tagen werden osmotische Minipumpen der Firma Alzet vom Typ 2004 (Charles River) mit einem Befüllungsvolumen von 100
desinfiziert. Nach einem kleinen Hautschnitt wird subkutan eine kleine Tasche gebildet, in die dann die Pumpe vorgeschoben wird
(11x2mm, Braun) verschlossen. Das
noch unter Narkose subkutan Metamizol gegeben der Operation dem Trinkwasser beigefügt.
werden regelmäßig kontrolliert. Die Wu ab.
3.1.2.3
Die Operationen sowie die Versuchsdurchführung erfolgt in den Laboren des Instituts für Vegetative Physiolologie und Pathophysiologie in Kooperation mit Herrn Professor
Eh
radiotelemetrischen Messung von mittlerem arteriellen Blutdruck, Herzfrequenz und lokomotorische
Mausgruppen basal sowie nach LPS Injektion werden die Abbildung 10:
Osmotische Minipumpe
Abbildung 11:
Telemetriesender
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von maximal 24 Stunden durch eine ebenfalls intraperitoneale Gabe von Ketamin/Xylazin anästhesiert und nach Organentnahme durch zervikale Dislokation sakrifiziert.
Analog zu den LPS Injektionen werden 100 µl 15N-Argininlösung injiziert.
Nach vier Stunden wird unter Isofluran Narkose die Blase punktiert und Urin entnommen, anschließend erfolgt ebenfalls die Sakrifizierung.
IMPLANTATION VON OSMOTISCHEN MINIPUMPEN
Zur kontinuierlichen Gabe von ADMA (250 µmol/kg/Tag) über einen Zeitraum von 28 Tagen werden osmotische Minipumpen der Firma Alzet vom Typ 2004 (Charles River)
einem Befüllungsvolumen von 100 μl und einer Pumprate von 0,11
Die Pumpen werden mit der ADMA Lösung entsprechend den Angaben des Herstellers befüllt und 24 Stunden vor der OP in physiologischer Kochsalzlösung bei 37°C zum Vorpumpen inkubiert. Nach erfolgter Narkotisierung de Tieres wird das Operationsfeld am Abdomen rasiert und desinfiziert. Nach einem kleinen Hautschnitt wird subkutan eine kleine Tasche gebildet, in die dann die Pumpe vorgeschoben wird. Der Hautschnitt wird mit Wundklammern (11x2mm, Braun) verschlossen. Das OP-Gebiet wird erneut desinfiziert, zur Analgesie wird noch unter Narkose subkutan Metamizol gegeben und für die nächsten zwei Tage nach der Operation dem Trinkwasser beigefügt. Die Wundheilung und der Sitz der Pumpe werden regelmäßig kontrolliert. Die Wundklammern fallen nach der Abheilung selbständig
3.1.2.3 TELEMETRISCHE MESSUNGEN
Die Operationen sowie die Versuchsdurchführung erfolgt in den Laboren des Instituts für Vegetative Physiolologie und Pathophysiologie in Kooperation mit Herrn Professor
Ehmke durch Frau Birgit Hirsch-Hoffmann.
radiotelemetrischen Messung von mittlerem arteriellen Blutdruck, Herzfrequenz und lokomotorische
Mausgruppen basal sowie nach LPS Injektion werden die von maximal 24 Stunden durch eine ebenfalls intraperitoneale Gabe von Ketamin/Xylazin
hme durch zervikale Dislokation sakrifiziert.
Argininlösung injiziert.
Nach vier Stunden wird unter Isofluran Narkose die Blase punktiert und Urin entnommen,
PUMPEN
/kg/Tag) über einen Zeitraum von 28 Tagen werden osmotische Minipumpen der Firma Alzet vom Typ 2004 (Charles River) nd einer Pumprate von 0,11 μl/h verwendet.
Die Pumpen werden mit der ADMA Lösung entsprechend den Angaben des Herstellers befüllt und 24 Stunden vor der OP in physiologischer Kochsalzlösung bei 37°C zum Vorpumpen inkubiert. Nach erfolgter Narkotisierung des Tieres wird das Operationsfeld am Abdomen rasiert und desinfiziert. Nach einem kleinen Hautschnitt wird subkutan eine kleine Tasche gebildet, in Der Hautschnitt wird mit Wundklammern Gebiet wird erneut desinfiziert, zur Analgesie wird und für die nächsten zwei Tage nach Die Wundheilung und der Sitz der Pumpe ndklammern fallen nach der Abheilung selbständig
Die Operationen sowie die Versuchsdurchführung erfolgt in den Laboren des Instituts für Vegetative Physiolologie und Pathophysiologie in Kooperation mit Herrn Professor Hoffmann. Zur radiotelemetrischen Messung von mittlerem arteriellen Blutdruck, Herzfrequenz und lokomotorischer Aktivität der Mausgruppen basal sowie nach LPS Injektion werden die
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Transmitter (PhysioTel® PA Implants) vom Typ TA11PA-C20 genutzt. Die Tiere werden durch die intraperitoneale Gabe von Ketamin (120 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (18 mg/kg Körpergewicht) narkotisiert und vom Hals bis zum Sternum rasiert, die Fläche wird mit Betaisodona Lösung desinfiziert. Die Maus wird zur Implantation des Katheters in Rückenlage auf einer auf 37°C temperierten Wärmeplatte fixiert um eine Auskühlung zu verhindern. Die Freipräparation der linken A. carotis communis wird unter stereomikroskopischer Aufsicht (LEICA MZ 75) durchgeführt. Die Arterie wird hinter einem angebrachten Haltefaden eröffnet und der Katheter wird implantiert und soweit vorgeschoben, bis die Spitze in den Aortenbogen hineinragt, dort wird er fixiert.
Anschließend erfolgt die Plazierung des Telemetriesenders im Flankenbereich des Tieres, und der Verschluss der Wunde mit einer Einzelknopfnaht (Mersilene 5-0, Ethicon).
Am siebten Tag postoperativ wird mit den Messungen begonnen, wobei zunächst vier Tage lang eine baseline ermittelt wird, dann erfolgt eine Injektion von LPS nach der die Tiere dann für weitere 24 Stunden beobachtet werden. Die Tiere bleiben dazu in ihren Käfigen, die Übertragung der radiotelemetrischen Daten erfolgt kontinuierlich über den implantierten Sender auf einen Computer. Die gemessenen Daten werden automatisch gespeichert und mit dem Programm Dataquest A.R.T. Data Analysis ausgewertet.
3.1.2.4 ORGANENTNAHME
Nach der Narkotisierung des Tieres durch die Gabe von Ketamin (120 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (18mg/kg Körpergewicht) oder einer inhalativen Isoflurannarkose erfolgt zunächst eine Überprüfung des Schmerzreizes. Ist dieser völlig ausgeschaltet, wird das Tier zur Organentnahme in Rückenlage verbracht und fixiert. Es folgt die Eröffnung des Abdomens über die Medianlinie. Anschließend wird das Darmkonvolut ausgelagert und das Zwerchfell durchschnitten, die Blutentnahme erfolgt durch die Punktierung des Herzens. Das Blut wird umgehend heparinisiert und für 10 min bei 5000 rpm und 4°C abzentrifugiert, der Überstand wird bis zur weiteren Verwendung bei -20°C eingefroren. Anschließend werden die Aorta, Nieren, Herz und Leber vorsichtig entnommen und bis zur Feinpräparation in physiologischer PBS Lösung bei 4°C aufbewahrt. Unter mikroskopischer Kontrolle erfolgt die vorsichtige Entfernung des
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umgebenden Bindegewebes der Organe und die Spülung verbleibender Blutreste durch intravasale Applikation der PBS Lösung. Die präparierten Organe werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt. Für Immunhistologische Analysen werden die Organe in tissue-tek (Sakura) gewebeschonend zunächst in Methylbutan und dann in flüssigem Stickstoff in Blöcken eingefroren.