3 Material und Methoden
3.4 Befunderhebung, Auswertung und Statistik
Die histologischen und immunhistologischen Schnittpräparate wurden mit Hilfe eines Standard Binokular Mikroskops (Zeiss, Oberkochem) lichtmikroskopisch ausgewertet. Die HE-gefärbten Gewebeschnitte wurden entsprechend der WHO-Klassifikation für Neoplasien des Mammadrüsengewebes (MISDORP et al., 1999) beurteilt.
In jedem immunhistologischen Schnittpräparat wurden anhand eines Auswertungsprotokolls die Intensität und die Anzahl der spezifischen Markierung erfasst.
Es wurden dabei folgende Zellen und Gewebestrukturen beurteilt:
A) Drüsengewebe der Kontrollgruppe und des hyperplastischen Mammagewebes und sowie nicht-tumorös verändertes Drüsengewebe der Tumorpatienten:
• Alveoläre Epithelien
• Duktepithelien
• Myoepithelien
• Stromale Bindegewebszellen (in Tumorpatienten in „tumornah“ und „tumorfern“
unterschieden und in der Kontrollgruppe und in hyperplastischem Drüsengewebe als „tumorfern“ definiert.)
• Stromale Gefäße (in Tumorpatienten in „tumornah“ und „tumorfern“ unter-schieden und in der Kontrollgruppe und in hyperplastischem Drüsengewebe als
„tumorfern“ definiert.)
B) Tumorgewebe:
• Epithelien (beinhalten alveoläre Epithelien benigner Mammatumoren und Epithelzellen maligner Mammatumoren in Tumorperipherie und Tumorzentrum)
• Myoepithelien (Tumorperipherie und Tumorzentrum)
• Metastasierende, epitheliale Tumorzellen in Gefäßen, Stroma und Lymphknoten
• Knorpelgewebe im Tumor
Die Auswertung der immunhistologischen Färbungen erfolgte durch die Doktorandin und einen Pathologen. Diskrepanzen in der Bewertung wurden durch eine gemeinsame Schnitt-Kontrolle behoben. Für die Auswertung der Immunhistologie wurden für jeden einzelnen Zelltyp und jede Lokalisation die Parameter Signalintensität (I) sowie die geschätzte Anzahl positiver Zellen (A) pro Gesichtsfeld bei hoher Vergrößerung (Objektivvergrößerung: 40x) nach zwei unterschiedlichen Bewertungssystemen bestimmt.
Für die Beurteilung der Intensität des immunhistologischen Signals wurde eine Bewertungsskala zugrunde gelegt, die von 0 bis 3 reichte.
Es wurde zugeordnet:
0 = kein Signal;
1 = schwaches Signal / leichte Braunfärbung;
2 = mäßig positives Signal / deutliche,mittelgradige Braunfärbung;
3 = stark positives Signal/ sehr deutliche, hochgradige Braunfärbung.
In Einzelfällen wurden für die exakte Beschreibung der Intensität eines Signals auch Zwischenstufen dieser Skala in Form von halben Zahlen verwendet.
Die Anzahl der markierten Zellen wurde semiquantitativ durch Schätzung erfasst und folgende Werte der geschätzten prozentualen Häufigkeit positiver Zellen zugeordnet:
0 = 0% der Zellen markiert;
1 = 1 – 25% der Zellen markiert;
2 = 26% – 50% der Zellen markiert;
48 Material und Methoden
3 = 51% – 75% der Zellen markiert;
4 = > 75% der Zellen markiert.
Dabei wurden für beide Parameter Werte für jeden zu untersuchenden Zelltyp in jeder Lokalisation fünfmal randomisiert ermittelt. Aus diesen fünf Einzelbeurteilungen wurde ein Mittelwert errechnet, der für die Intensität zwischen 0,0 und 3,0 (Intensitätswert, I) und für die geschätzte Anzahl positiver Zellen zwischen 0,0 und 4,0 liegen konnte (Häufigkeitswert, A). Für den Fall, daß alle fünf randomisiert erhobenen Einzelwerte für die Intensität einer Lokalisation in keinem Fall einen Einzelwert über 0,5 erreichten, und somit auch der Intensitätswert kleiner gleich 0,5 war, musste angenommen werden, dass diese schwache Färbung in einer geringen Anzahl von Zellen auf einem unspezifischem Hintergrundsignal beruht. Per Konvention wurden die Intensitätswerte aller Lokalisationen mit Hilfe der Untersuchungsbögen auf ihre Einzelwerte hin überprüft und gegebenenfalls „bereinigt“, d.h.
auf „Null“ gesetzt.
Für die deskriptive und statistische Auswertung der immunhistologischen Ergebnisse und ihre graphische Darstellung wurde durch Zusammenfassung von Intensitäts- und Häufigkeitswerten aller korrespondierender Lokalisationen und Zelltypen ein immunhistolo-gischer „Score“ (SINICROPE et al., 1995) erstellt, der sich durch Multiplikation der nicht gerundeten Intensitäts- und Häufigkeitswerte ergab und zwischen 0 und 12 liegen konnte.
„Scores“ ≤ 3 wurden nachfolgend als „niedrig“, von 4 – 6 als „mittlere“ Werte, von 7 – 9 als
„hoch“ und von 10 – 12 als „sehr hoch“ bezeichnet.
Um einen Vergleich zwischen alveolären Epithelien des histologisch unveränderten Drüsengewebes und dem Tumor zu ermöglichen, wurde für Epithelien aus Tumorperipherie und -zentrum ein Tumorgesamtwert (TgesAE) ermittelt. Dieser war das Produkt aus dem arithmetischen Mittel der Intensitätswerte von Zentrum und Peripherie [(ITpAE + ITzAE)/2], bzw. aus dem arithmetischen Mittel der Häufigkeitswerte [(ATpAE + ATzAE)/2]. Analog dazu wurden die Werte von Emboli, lokal invasiven metastasierenden Zellen sowie Lymph-knotenmetastasen zu einem Metastasengesamtwert (TgesMETZ) zusammengefasst. Auch hier wurde durch Bildung eines arithmetischen Mittels jeweils ein Intensitäts- bzw. Häufig-keitsgesamtwert für die Metastasen ermittelt. Durch ihre Multiplikation wurde der Tumorgesamtwert für metastatische Zellen unabhängig von ihrer Lokalisation errechnet.
So entstanden pro untersuchtem Antikörper 19 „Scores“ für 19 untersuchte Lokalisationen.
Die im folgenden verwendete Bezeichnung „SCORE“ beschreibt, dass der vorhandene Wert durch Multiplikation von Intensitäts- und Häufigkeitswerten der entsprechenden Lokalisation zustande gekommen ist. Für die Deskription der Signale wurden dezimale „Scores“ nach allgemein anerkannten Rundungsregeln auf- oder abgerundet.
Für folgende Zellen und Strukturen wurden „Scores“ erhoben:
Normale alveoläre Epithelien: NAE
Normale Duktepithelien: NDE
Normale Myoepithelien: NME
Tumornahes Stroma: Stroma-Nah
Tumorfernes Stroma: Stroma-Fern
Tunica media von tumornahen Gefäßen: T.m.-Nah
Tunica media von tumorfernen Gefäßen: T.m.-Fern-
Intima von tumornahen Gefäßen: Int.-Nah
Intima von tumorfernen Gefäßen: Int.-Fern
Tumorgesamtwert für alveoläre Epithelien: TgesAE
Epithelien der Tumorperipherie: TpAE
Epithelien des Tumorzentrums: TzAE
Myoepithelien der Tumorperipherie: TpME
Myoepithelien des Tumorzentrums: TzME
Metastasengesamtwert: TgesMETZ
Emboli in Gefäßen und Lymphspalten: Emboli
Lokal invasive Zellen im Gewebe: MetZ
Lymphknotenmetastasen: LnnMet
Knorpelzellen in benignen Mischtumoren Chondro
50 Material und Methoden
Prozentangaben im deskriptiven Ergebnisteil beziehen sich immer anteilig auf die jeweilige Tumorgruppengröße. Konnten Einzelwerte aus verschiedenen Gründen (z.B. Lokalisation nicht beurteilbar, Parameter nicht vorhanden) nicht erhoben werden, so bezieht sich die Prozentangabe dennoch auf die ursprüngliche Gruppengröße.
Die statistische Aufarbeitung der bei der Untersuchung der Hundegruppen erhobenen Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informations-verarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die immunhistologischen „Scores“ der Untersuchungsgruppen wurden unter Verwendung des Programmes SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) bearbeitet sowie deren graphische Darstellun-gen mit dem Programm SPSS (Superior Performing Software Systems, Version 13.0) erzeugt.
Da sich die erhobenen Daten mehrheitlich nicht als normalverteilt erwiesen, wurde für weitere Analysen der Tumorgruppen der Kruskal-Wallis-Test (KWT) als nicht-parametrische Varianzanalyse unabhängiger Stichproben als Globaltest, eingesetzt. Dieser verglich je Antikörper die immunhistologischen „Scores“ der sieben Gruppen auf signifikante Unterschiede folgender Parameter:
Unverändertes Drüsengewebe (NAE, NDE, NME), Tumorgesamtwert für Epithelien (TgesAE),
Tumorgesamtwert für Epithelien (TgesAE) aller Gruppen mit NAE der Kontrollgruppe, Epithelien von Tumorperipherie und -zentrum (TpAE, TzAE),
Myoepithelien von Tumorperipherie und -zentrum (TpME, TzME), Tumornahes und –fernes Bindegewebe (Stroma-Nah, Stroma-Fern), Tunica media tumornaher und –ferner Gefäße (T.m.-Nah, T.m.-Fern), Intima tumornaher und –ferner Gefäße (Int.-Nah, Int.-Fern).
Für die Benennung der statistischen Signifikanzen wurde ein vergleichsbezogenes Signi-fikanzniveau von α = 0,05 zu Grunde gelegt. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Ein paarweiser Gruppenvergleich oben angegebener Parameter wurde in den Fällen durchgeführt, in denen der Kruskal-Wallis-Test signifikant war. Als nicht-parametrischer Test für unverbundene Stichproben wurde der Wilcoxon-U-Test (WT) eingesetzt und eine versuchsbezogene Irrtumswahrscheinlichkeit durch „α-Adjustierung nach Bonferroni“ mit einem Signifikanzniveau von α = 0,005 (TgesAE, TpAE, TzAE, Stroma-Nah, T.m.-Nah,
Int.-Nah) bzw. α = 0,00238 (NAE, NDE, NME, Stroma-Fern, T.m.-Fern, Int.-Fern), α = 0,0167 (TpME, TzME), α = 0,01 (TgesAE aller Tumorgruppen verglichen mit Epithelien der Kontrollgruppe) erreicht (Anhang, Abschnitt 9.3, Tab. 9.44 bis Tab. 9.50). Bei diesem Verfahren werden Werte mit einem Signifikanzniveau p < 0,05 als „statistisch auffällig“
bezeichnet.
Innerhalb einer Tumorgruppe wurde die Untersuchung auf signifikante Unterschiede verschiedener Parameter mit dem Signed-Rank-Test nach Wilcoxon (SRT) durchgeführt.
Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als „statistisch signifikant“ angesehen. Folgende Parameter innerhalb gleicher Tumorgruppen wurden mit dem Signed Rank-Test nach Wilcoxon miteinander verglichen:
In jeder Tumorgruppe wurde unverändertes Drüsengewebe (NAE) dem Tumorgesamtwert für Epithelien (TgesAE) gegenübergestellt. In einfachen Karzinomen war dieser Vergleich durch das Fehlen entweder des unveränderten Drüsengewebes oder eines soliden Tumors nicht in allen Fällen möglich. Unter der Voraussetzung, daß sich TgesAE und TgesMETZ im Signed Rank-Test nicht signifikant (p < 0,05) unterschieden, wurde für die Fälle, in denen aufgrund des Fehlens eines Tumorknotens kein Tumorgesamtwert ermittelt werden konnte, der Metas-tasengesamtwert berücksichtigt und so ein modifizierter Tumorgesamtwert (TgesAE-modif.) erstellt. Dies erhöhte die Anzahl der Vergleiche zwischen nicht-neoplastischen und neoplas-tischen Epithelzellen.
Innerhalb jeder Tumorgruppe wurden die Epithelien der Tumorperipherie (TpAE) mit denen des unveränderten Drüsengewebe (NAE) verglichen.
In jeder Tumorgruppe wurden Tumorperipherie und Tumorzentrum einander gegenüber-gestellt und für Epithelien (TpAE - TzAE) bzw. Myoepithelien (TpME – TzME) auf signifikante Unterschiede getestet.
Des Weiteren wurden in jeder Tumorgruppe tumornahes und –fernes Bindegewebe miteinander verglichen (Stroma-Nah – Stroma-Fern).
52 Material und Methoden