3 Ergebnisse
4.4 Bedeutung der PI3K/AKT und RAS/RAF/MEK/ERK Signalwege und aktiviertem
134 der klinischen Studie erreicht haben, durch orale Medikation meist gut toleriert (Smith et al., 2004, Stone et al., 2005, Fiedler et al., 2005). Dennoch ist es nicht selten, dass diese Patienten einen Rückfall erleiden und die leukämischen Zellen wieder auswachsen. Deshalb wenden immer mehr Studien die Kombination von klassischer Chemotherapie und zusätzlicher Gabe von Inhibitoren oder aber die Kombination zweier Inhibitoren zusammen an, um einen Rückfall oder eine Resistenz der Zellen zu umgehen (Brown et al., 2004 und 2005, Armstrong et al., 2003).
4.4 Bedeutung der PI3K/AKT und RAS/RAF/MEK/ERK Signalwege und
135 festzustellen, dass die beiden Signalwege für die Proliferation und das Überleben der FLT3-ITD B-Zell ALL Tumorzellen eine wichtige Bedeutung hatten, was durch die in dieser Arbeit durchgeführten Inhibitorversuche gezeigt werden konnte.
Die Wichtigkeit der PI3K/AKT- und RAS/RAF/MEK/ERK-Signalwege, die durch FLT3-ITD stimuliert werden, die bereits in früheren Studien von Brandts et al., in 2005 gezeigt wurde, welche zeigten, dass ein aktiviertes AKT Signal für die Leukämogenese, die Proliferation und das Überleben von myeloiden FLT3-ITD transformierten Zellen unabdingbar war. Obwohl interessanterweise davon ausgegangen wird, dass RAS Mutationen in 10% der erwachsenen AML-Patienten vorkommen (Bos et al., 1987, Bowen et al., 2005), sind RAS Mutationen in ALL Patienten seltener vorzufinden. So zeigt eine Studie von Paulsson et al., 2008, dass RAS-Mutationen in ca. 20% (n=78) von ALL-Patienten vorkommen, die einen hyperdiploiden Chromosomensatz besitzen. Dennoch sind somatische Mutationen der Mitglieder der beiden Signalkaskaden wie AKT1 oder PI3KCA sehr selten in AML oder ALL Proben identifiziert worden. Auf der anderen Seite wurden diese Mutationen häufig in soliden Tumoren gefunden (Carpten et al., 2007, Davies et al., 2002). Es wurde zudem bestätigt, dass aktivierte Formen der PI3KCA zu der Transformation von myeloiden Zellen führen können (Horn et al, 2008). Obwohl die hier präsentierten Ergebnisse eine wichtige Rolle des PI3K/AKT sowie RAF/MEK/ERK Signalweges in den FLT3-ITD induzierten B-ALL bestätigen konnte, bleibt unklar, ob diese Signalwege auch in anderen ALL Subtypen, die keine aktivierende FLT3 Mutation besitzen, eine Rolle spielen. Aktivierte RAS/RAF/MEK/ERK- und PI3K/AKT Signalwege sind ein Kennzeichen für AML-Subklassen, was im Gegensatz zu ALL-Patientenproben steht (Martelli et al., 2006, Platanias et al., 2003).
4.4.2 Aktivierung von STAT5
STAT5 wird häufig in Krebserkrankungen und Leukämien als aktiviertes Protein gefunden.
So ist die Aktivierung von STAT5 mit dem Hodgkin-Lymphom (Scheeren et al., 2008), chronischer myeloider Leukämie (Poincloux et al., 2007) und Brustkrebs (Young et al., 2005) assoziiert. Aber auch in der akuten myeloiden Leukämie wurde die STAT5-Aktivierung durch FLT3-ITD beobachtet (Schmidt-Arras et al, 2009). Die transformierende Rolle von STAT5 in Leukämien, in denen FLT3 mutiert ist, wird durch die Beobachtung unterstützt, dass durch die Stimulation des wt FLT3 Rezeptors mit dem FLT3-Liganden auf der einen Seite STAT5 kaum aktiviert wird, während auf der anderen Seite die FLT3-ITD Mutation und die
136 Kinasedomäne-Mutation von FLT3 eine starke Aktivierung von STAT5 zeigen. Die Phosphorylierung/Aktivierung von STAT5 ist bei dem FLT3-ITD Rezeptor am stärksten.
Diese starke Aktivierung durch FLT3-ITD könnte dadurch zustande kommen, dass durch die interne Tandem Duplikation für die Aktivierung von STAT5 wichtige Tyrosinreste (589 und 591) verdoppelt wurden (Rocnik et al., 2006). Bisher wird angenommen, dass STAT5 durch einen Janus Kinasen-unabhängigen Weg in FLT3-ITD transformierten Zellen aktiviert wird (Choudhary et al., 2007). Ob dies durch einen zwischengeschalteten Effektor geschieht oder aber durch FLT3-ITD direkt ist noch unklar.
In dieser Arbeit konnte die Wichtigkeit der durch FLT3-ITD induzierten STAT5 Aktivierung durch die Expression von dominant negativen Formen von STAT5a oder STAT5b in FLT3-ITD Tumorzellen bestätigt werden. Die Transduktion der lymphoiden FLT3-FLT3-ITD Tumorzellen mit dominant negativen STAT5 Mutanten hat ähnlich wie in den Inhibitorversuchen eine Reduktion in der Kolonienbildung als auch der lebenden Zellen im Gegensatz zum Neo-Kontrollvektor gezeigt. Die Western Blot Analyse der Tumorzellen hat gezeigt, dass das stromabwärts von STAT5 liegende Effektormolekül BCL-XL durch die Expression der dominant negativen STAT5-Proteine herunterreguliert war. Dies zeigte abermals die Funktionalität der Mutanten in den Tumorzellen. Die Ergebnisse lassen darauf hindeuten, dass auch die Aktivierung des STAT5 Proteins für die Proliferation und das Überleben der FLT3-ITD Tumorzellen essentiell war.
Diese Ergebnisse waren unerwartet, da frühere Studien die Hypothese unterstützt haben, dass die Aktivierung von STAT5 durch FLT3-ITD eine wichtige Komponente der myeloiden aber nicht der lymphoiden Transformation darstellt (Grundler et al, 2005). In der Studie von Grundler et al. wurde gezeigt, dass eine FLT3-TKD Punktmutante im Mausmodell zu einem oligoklonalen lymphoproliferativen Phänotyp führte, dessen Latenzzeit im Vergleich zu der FLT3-ITD Mutation, die zu einem myeloproliferativen Phänotyp führte, wesentlich länger war.
Diese Hypothese wird durch die Beobachtung unterstützt, dass FLT3-TKD Mutationen, die eine viel schwächere Aktivierung des STAT5 Proteins zeigen, in einer ca. 8-fach höheren Frequenz im Gegensatz zu FLT3-ITD Mutationen in ALL gefunden werden. Das Gegenteil ist in AML-Proben der Fall: Hier kommt die ITD Mutation des FLT3 Rezeptors in ca. 10-27% der Patienten vor, während die TKD Mutation in etwa 3-7% der Fälle identifiziert wurde (Small 2006, Armstrong und Look, 2005, Paulsson et al., 2008, Taketani, 2004). Dieser Zustand könnte darauf hinweisen, dass niedrige Level des aktivierten STAT5-Proteins, die durch die FLT3-TKD Mutation induziert wurden, ausreichend sind, um die Transformation der frühen
B-137 Zelllinie zu bewirken, jedoch nicht der myeloiden Linie. Folglich angenommen, dass die Frequenz dieser Mutation in beiden hematopoetischen Linien gleich ist, kommt sie nicht exklusiv in der myeloiden Linie vor.
Zwei Anhaltspunkte unterstützen diese Hypothese: Erstens wird die Wichtigkeit von STAT5 in der Lymphopoese in einem Mausmodell gezeigt, in dem das Fehlen von STAT5 zu einer Störung der Entwicklung lymphatischer Zellen führte. Es kam zu einer Blockade der Differenzierung im frühen Pro-B Zellstadium (Goetz et al., 2004). Ein ähnlicher Phänotyp wurde in dem Knockout-Mausmodell beobachtet, in dem der IL7R ausgeschaltet wurde, was die Bedeutung von STAT5, das dem IL7R nachgeschaltet ist, wieder hervorhebt. Zweitens wurde in einem Mausversuch von B. Niebuhr aus unserer Arbeitsgruppe eine aktivierende STAT5 Mutante in C57BL/6 Mäuse eingebracht. Es gelang, einen ähnlichen Defekt in der B-Zell Differenzierung zu zeigen, wie es in dem FLT3-ITD Mausmodell in dieser Arbeit der Fall war. Allerdings konnte keine Leukämie durch das aktivierte STAT5 Protein induziert werden.
Offensichtlich sind für eine stärkere Proliferation und Überlebenssignale, die Aktivierung des PI3K- und/oder des RAS/MEK-Signalwegs erforderlich, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt. Die hier erlangten Ergebnisse deuten zudem darauf hin, dass auch STAT5 für die Blockade der Differenzierung der FLT3-ITD Tumorzellen wichtig ist und bringt die interessante Hypothese auf, dass die anormale Aktivierung von FLT3 in der Lage ist, Mutationen der Klasse eins sowohl als auch Mutationen der Klasse zwei zu modulieren.
Jedoch verbleibt die Frage, ob andere kooperierende Mutationen, unabhängig von dem FLT3-ITD Signalweg, notwendig waren, um die Leukämie in dem FLT3-ITD ALL Mausmodell auszulösen.