Es wurde mit einem DH5α Escherichia coli Stamm gearbeitet (Stratagene, La Jolla, USA).
2.6.1 Transformation von Plasmiden in E. coli-Bakterien
Ziel der Transformation war es, Plasmide mit Hilfe von E. coli-Bakterien zu vermehren.
Dabei nahmen die Bakterien die Plasmide mittels Hitzschock und Elektroschock auf. 50 µl der DH10B kompetenten E. coli-Bakterien wurden mit 0,5 µg Vektor (PCMS-PRNP-EGFP) vermischt. Elektrische Küvetten wurden für 5 min auf Eis gelegt. Die Zellen und die DNA (Vektor) wurden in die gekühlten Küvetten gegeben und für weitere 2 min auf Eis inkubiert.
Es folgte ein elektrischer Schock, der zur Aufnahme der DNA in die Bakterien führte. 1 ml vorgewärmtes LB Medium (1% Trypton, 0,5% Hefe Extrakt, 171 mM NaCl) wurde für 45 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert und dabei geschüttelt. 10 µl der Kultur wurden in den 1 ml vorgewärmten LB Medium gelöst. 50 µl dieser Lösung wurden zum Wachsen auf
LB-Ampicillin-Agar-Platten (LB-Medium mit 1,5% Agar und Ampicillin 100 µg/ml) (Sigma, Seelze, Deutschland) als Selektionsantibiotika ausgesät und für 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nur Bakterien, die den Vektor mit der Ampicillinresistenz enthielten, überlebten.
Nach 12 bis 16 Stunden waren transformierte Bakterien auf dem Nährboden zu sehen. Mit einer sterilen Öse konnte die gewünschte Anzahl von Bakterienkolonien in 100 ml Ampicillin-haltiges LB-Medium (100 µg/ml) überführt werden. Die Bakterien wuchsen über Nacht bei 37 °C zu einer Dichte von OD600= 0,5-0,8 an und standen wegen des Ampicillins unter Selektionsdruck. Die Plasmide konnten mit Hilfe eines Plasmid Isolation Kit (Qiagen) aus den Bakterien isoliert bzw. die transformierten E.coli-Bakterien zur Langzeitlagerung eingefroren werden. Dazu wurden 850 µl der Bakterienkultur mit 150 µl Glycerin in ein geeignetes Gefäß pipettiert und bei -80 °C eingefroren.
2.6.2 Plasmide
Die verwendeten Plasmide dieser Arbeit sind in der Tabelle 4 aufgelistet, eine schematische Darstellung des pCMS-PRNP-EGFP-Genoms ist in Abb. 5 zu sehen.
Name relevante Eigenschaften Herkunft
pCMS-EGFP Expressions Vektor; CMV IE BD Biosciences, Palo Alto, USA
pCMS-PRNP-EGFP Promotor; SV 40 Promotor;
Ampr
Klinik für Neurologie, Universitätsmedizin Göttingen, D
Tabelle 4: Plasmide
Abbildung 5: Schematische Darstellung des pCMS-EGFP-Plasmids (Ramljak 2007, S. 34) 2.6.3 Plasmid-DNA-Extraktion (Minipräparation)
Für die Minipräparation wurde das High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Applied Science (Mannheim, Deutschland) verwendet. Zunächst wurde 50 ml LB-Medium (+ 100 µg/ml Ampicillin) bei 37 °C im Wasserbad erwärmt und 50-100 µl der transformierten Bakterien (nach kurzem Antauen aus dem -80 °C-Kühlschrank) in das Medium gegeben. Die Bakterien wuchsen über Nacht (16 Stunden) bei 37 °C. Von dieser Zellsuspension wurden 20 ml für 5-10 min bei 6000 x G zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen mit einer optischen Dichte zwischen 1,5 und 5,0 (A600 units pro Milliliter) nach folgendem Schema behandelt. Zunächst wurden die Zellen in 250 µl RNase Puffer (P1) resuspendiert. Durch Zugabe von P2 Lyse-Puffer startete die Lysereaktion für 5 min. Die Lysereaktion wurde durch Hinzufügen von 350 µl des vorher auf Eis gelegten P3 Binding-Puffers neutralisiert und die Suspension für 5 min auf Eis inkubiert. Die DNA, Proteine und Zelldepritus präzipitierten in weißen Flocken aus. Es wurde 10 min bei 13,000 x G in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand mit der Plasmid-DNA in ein Filter Tube überführt und erneut für 1 min bei max. Geschwindigkeit zentrifugiert. Durch Zugabe von 700 µl P4 Wasch-Puffer und zweimaligem zentrifugieren (je 1 min bei maximaler Geschwindigkeit) wurde die DNA gereinigt. Sie befand sich nun in dem Filter. Der Filter wurde in ein neues steriles 1,5 ml
Eppendorfgefäß gegeben und durch 100 µl P5 Elutions-Puffer, erneutes maximales Zentrifugieren für 1 min wurde die DNA aus dem Filter gewaschen und befand sich nun in dem Eppendorfgefäß. Der Plasmid konnte bei -4 °C eingefroren oder direkt für weitere Versuche verwendet werden.
2.6.4 Plasmid-DNA-Extraktion (Midipräparation)
Für die Midipräparation wurde das Plasmid Midi- und Maxi- Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) verwendet. Im Vergleich zu der Minipräparation ließen sich hierbei größere Mengen an DNA extrahieren. Nachdem die Bakterien über Nacht gewachsen waren, wurde wie in der Anleitung beschrieben vorgegangen. Die Bakterien wurden bei 4 °C für 15 min bei 6000 x G zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in 4 ml Puffer 1 resuspendiert, mit 4 ml Puffer 2 gemischt und für 5 min bei RT inkubiert. Die Bakterien waren nun lysiert. Für die Präzipitation wurde auf Eis gekühlter Puffer 3 dazugegeben und für 15 min auf Eis inkubiert.
Im Anschluss wurde alles bei 20000 x G für 30 min bei 4 °C zentrifugiert, so dass der Überstand die DNA enthielt und diese dann erneut bei 20000 x G für 15 min bei 4 °C zentrifugiert wurde. Der DNA-haltige Überstand wurde nun durch Qiagen-tip 100 Filter filtriert. Um die DNA zu lösen, wurden 5 ml Puffer QF filtriert und die DNA anschließend mit 3,5 ml Isopropanol gelöst und sofort zentrifugiert bei 4 °C für 15 min bei 15000 x G. Der Überstand wurde vorsichtig verworfen und das Pellet mit 2 ml 70% Ethanol gewaschen und bei 15000 x G für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet für 5-10 min an der Luft getrocknet. Anschließend konnte die DNA eingefroren oder sofort verwendet werden.
2.6.5 Plasmidnachweis
Der Plasmidnachweis erfolgte durch die DNA-Agarose-Gelelektrophorese. Dazu wurden 0,8 g Agarose mit 40 ml TAE-Puffer durch Erhitzen in der Mikrowelle zu 2%igem Agarosegel hergestellt. Nach Abkühlung auf RT wurden 1,4 µl Ethidiumbromid in die Agarose gegeben, alles in eine Agarose-Gelkammer gegossen und die Kämme für die Gelkammern eingesetzt.
Nachdem das Gel auspolymerisiert war, wurden 20 µl der Probe in die Gelkammern pipettiert (18 µl DNA + 2 µl Loading-Buffer). Die Gele liefen in TAE-Puffer bei 80 V für 30 min. Die DNA-Banden wurden durch UV-Licht von 302 nm in Gel Documentation 2000TM UV-Transiluminator (Bio-Rad, München, Deutschland) sichtbar gemacht. Durch einen mitlaufenden DNA-Standard wurden die DNA-Fragmente identifiziert. Die Konzentration wurde mit einem Fotometer (Bio Fotometer, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bestimmt.