Carolina Cornejo, Salome Schneider Zusammenfassung
Im Routinebetrieb wurden 1584 biologische Proben von Bakterien, Insekten, Nematoden, Oomyzeten und Pilzen molekulargenetisch analysiert. Diese stammten aus Inspektionen, aus der Überwachungstätigkeit von Waldschutz Schweiz sowie aus speziellen Erhebungen zum Auftreten von Quarantäneorgansimen.
Bei den Analysen der Proben kommen verschiedene molekulargenetische Methoden zur Anwendung, die es erlauben spezifische Quarantäneorganismen nachzuweisen oder allge-mein Schadorganismen wie Pilze, Bakterien oder Insekten zu identifizieren. Diese Methoden werden laufend optimiert, um zusätzliche Organismen erweitert sowie deren Qualität, wenn möglich, in Zusammenarbeit mit anderen Diagnostiklabors überprüft.
1 Routinediagnostik
Im Routinebetrieb wurden 1584 DNA-Proben von Bakterien, Insekten, Nematoden, Oomyze-ten und Pilzen molekulargenetisch analysiert (Grafik 14). Davon stammOomyze-ten 75% aus der Tä-tigkeit von Waldschutz Schweiz. Ein Grossteil dieser Analysen (65%) betraf die Rotband- und Braunfleckenkrankheit. Ausser bei den Pilzen war im Vergleich zum Vorjahr bei allen anderen Organismengruppen eine Abnahme der Anzahl untersuchter Proben zu verzeich-nen. Dies ist vor allem darauf zu führen, dass 2017 umfangreiche Nematoden- und Phytoph-thora-Erhebungen durchgeführt wurden. Diese Erhebungen fanden 2018 wieder in einem regulären Umfang statt. Allerdings stellen sich dem Routinelabor zunehmend komplexere Aufgaben für einzelne Proben. Beispielsweise wurden Phytophthora ramorum-Verdachtsfälle von Jungpflanzenbetrieben, welche mit einer artspezifischen quantitativen PCR einen nega-tiven Befund ergaben, zusätzlich mit einer gattungsspezifischen PCR analysiert. So werden Verdachtsfälle zusätzlich auf andere Phytophthora-Arten überprüft.
Grafik 14 Anzahl untersuchter DNA-Proben im Jahr 2018 (Stand per 31. Dezember 2018).
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2016 2017 2018 2016 2017 2018 2016 2017 2018 2016 2017 2018 2016 2017 2018 Bakterien Insekten Nematoden Phytophthora Pilze
Anzahl DNA-Proben
WSS ISPM15 Monitoring Anderes
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2 Etablierung neuer molekularen Diagnostikmethoden
Anfang 2018 wurde das alte Gerät für die quantitative PCR (qPCR) durch den QuantStudio 5 von Life Technologies ersetzt und die existierenden qPCR-Diagnostikmethoden erfolgreich auf das neue Gerät überführt. Im Gegensatz zum alten Gerät verfügt das neue über einen zusätzlichen Farbkanal, was den gleichzeitigen Nachweis von bis zu fünf Ziel-Arten ermög-licht. Die neue Software erlaubt eine effizientere Auswertung der Daten sowie den externen Zugriff auf die laufenden Analysen.
Für die Routinediagnostik wurden in diesem Jahr weitere molekulare Detektions- und Quanti-fizierungsmethoden entwickelt, welche auf qPCR basieren. Dazu gehört die qPCR für den Nachweis des Quarantäneorganismus Ceratocystis platani als Erreger der Platanenwelke.
Entsprechend den Normen des EPPO-Standards PM 7/14(2) wurde die Nachweismethode des Pilzes in Holz etabliert. Die erneuten Fälle von C. platani aus dem Tessin im Sommer 2018 machen die Notwendigkeit einer schnellen, effizienten und robusten Nachweismethode umso deutlicher.
Eine weitere neue Methode ist die multiplexe qPCR, womit symptomatische Bäume gleich-zeitig auf die drei Bakterien Gibbsiella quercinecans, Brenneria goodwinii und Rahnella victo-riana untersucht werden können. Die drei Bakterien werden in Grossbritannien mit dem akuten Eichensterben in Zusammenhang gebracht und sind 2017 das erste Mal in der Schweiz auf Traubeneichen nachgewiesen worden. In Zusammenarbeit mit Sandra Denman von Forest Research in Surrey, Grossbritannien, wurde die Nachweismethode etabliert und weiterentwickelt. Dazu werden Proben mit Wattestäbchen, sog. Swab-Proben direkt von der Läsion entnommen. Mittels unterschiedlich fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden können die drei verschiedenen Bakterien in einer qPCR gleichzeitig nachgewiesen werden.
Für die DNA Extraktion von sehr kleinen Proben – in den meisten Fällen handelt es sich um Insekten – wurde die Anwendung des für die Forensik entwickelte „NucleoSpin Tissue XS Kit“ von Marcherey-Nagel etabliert.
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Tabelle 12 Molekulargenetische Methoden, die für den Nachweis von Quarantäneorganismen und ande-ren waldrelevanten Schadorganismen an der WSL verwendet werden. Für die hervorgehobenen Organis-men wurden in unserem Labor 2018 neue Diagnostikmethoden etabliert.
Schadorganismus Diagnostikmethode 1 Diagnostikmethode 2 Dothistroma septosporum,
Phytophthora ramorum qPCR (TaqMan) mit interner
Kontrolle Isolierung aus Pflanzen- und Boden-proben gefolgt von DNA-Barcoding*
Bursaphelenchus xylophilus qPCR (TaqMan) mit interner Kontrolle
Spezifische Endpunkt-PCR gefolgt von Gelelektrophorese
Gibberella circinata qPCR (TaqMan) Isolierung aus Samen und Pflanzen-proben gefolgt von DNA-Barcoding*
Ceratocystis platani qPCR (TaqMan) Isolierung aus Pflanzenproben ge-folgt von DNA-Barcoding*
Anoplophora glabripennis,
A. chinensis DNA- Barcoding* –
Cryphonectria parasitica Bestimmung der vc-Typen mittels Multiplex-PCR und Fragmentlängen-Analyse
Paarungstests mit EU Testerstäm-men
Phytophthora spp. DNA-Barcoding mit Phytoph-thora-spezifischen Primern
Rahnella victoriana Multiplex-qPCR (TaqMan) Isolierung aus Swab-Proben gefolgt von DNA-Barcoding*
Unbekannte Bakterien, Pilze
und Insekten DNA-Barcoding* _
* PCR und Sequenzierung mit universellen Primern
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3 Ausblick
3.1 Ausbau der Molekularen Diagnostik
Im Zusammenhang mit einem WSL-internen Projekt wurde ein Sequenziergerät von Oxford Nanopore Technologies angeschafft. Dabei handelt es sich um ein kleines, einfach zu be-dienendes Gerät der dritten Generation, welches die Sequenzierung von langen DNA-Abschnitten oder RNA in ihrer natürlichen Form ermöglicht. Die Technologie wurde 2014 lanciert und bisher kaum in der waldrelevanten Diagnostik eingesetzt. Deshalb ist das Ziel, an der WSL für das Gerät einen Arbeitsablauf zu etablieren, welcher eine schnelle, robuste und Kosten-effiziente Analyse von PCR-Amplikons zur Arten-Identifizierung erlaubt.
Eine Einsatzmöglichkeit der Nanopore-Technologie liegt bei der Identifizierung von Insekten.
Unser Labor ist regelmässig damit konfrontiert, dass Arten wegen unspezifischer Primerbin-dung nicht bestimmt werden können. In diesem Zusammenhang werden wir neue, Insekten-spezifische Primer testen. Zusätzlich möchten wir das Potential der Nanopore-Technologie bei der Sequenzierung des ganzen Mitochondrions testen. Damit können genetische Marker generiert werden, die sich für die Analyse von Verschleppungswegen (back, trace-forward analysis) eignen.
Beim weiteren Ausbau der Bakterien Diagnostik wird die Nanopore-Technologie auch eine Rolle spielen. Der Fokus liegt jedoch auf der Definition eines Arbeitsablaufes, welcher es ermöglicht, neue Erkrankungserscheinungen zu erkennen und diese Bakterien und möglich-erweise anderen Krankheitserreger zuzuordnen.
3.2 Teilnahme an einer Test Performance Study
Im Rahmen des EU Forschungsprojekts VALITEST (https://www.valitest.eu) nimmt unser Labor an einer Test Performance Study für den Nachweis von Bursaphelenchus xylophilus teil. Dabei sollen durch Zusammenarbeiten zwischen verschieden Labors neue Validie-rungsdaten generiert und dadurch eine Harmonisierung der Diagnostiktests erreicht werden.
Für unser Labor dienen solche Test Performance Studies in erster Linie der Qualitätssiche-rung und ermöglichen zusätzlich den Austausch mit anderen Diagnostiklabors.
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