Auswirkungen der neuen Nukleoside auf den globalen genomischen

einkovalenter Charakter zugesprochen werden kann. Durch die Verwendung von

3H-markiertem SAM ließe sich außerdem die Rolle des Kofaktors weiter untersuchen, da man so der Frage nachgehen könnte, ob bei der Reaktion die Übertragung einer Methylgruppe erfolgt oder nicht. Im Fall der Reaktion von M.HhaI mit einem Zebularin-enthaltenden DNA Strang beispielsweise findet nach Zhou kein Methyltransfer statt. Es bliebe zu klären, ob dies bei einem DNA Substrat mit dem modifizierten Molekül 34 auch noch zutrifft.^[32]

5.5.3 Auswirkungen der neuen Nukleoside auf den globalen genomischen

lediglich zwei Tage und in einer Konzentration von nur 2 µM zu den Zellen gegeben werden, um bereits einen drastischen Effekt zu erreichen. Der absolute Methylierungsgrad der Zellen wurde hierbei beispielsweise von 3.9 % auf 0.8 % erniedrigt. Damit zeigte die genomische DNA nach der Behandlung mit 5-Aza-dC nur noch 21.5 % des 5-Me-dC Gehalts der DNA der unbehandelten Zellen (Abbildung 5.11).

Abbildung 5.11: Auswirkung der neuen Nukleoside sowie der entsprechenden Referenzsubstanzen auf den globalen genomischen Methylierungsgrad von HCT116 Darmtumorzellen. Die Zellen wurden über vier Tage mit 20, 300 und 1000 µM der neuen Substanzen inkubiert (Referenzsubstanzen abweichend: 5: 2 d, 6: 3 d), und nach insgesamt sechs Tagen wurde die DNA extrahiert, einem enzymatischen Totalverdau unterworfen und per HPLC auf ihren 5-Me-dC Gehalt analysiert. Der Methylierungsgrad unbehandelter Zellen wurde auf 100 % gesetzt; der absolute Wert für HCT116 Zellen liegt bei 4 - 4.5 %.^{[265, 283]}

Als weitere Referenz diente Zebularin (6), das jedoch in Übereinstimmung mit der Literatur erst bei deutlich höheren Konzentrationen als 5 den Methylierungsgrad senkte: eine Konzentration von 1 mM Inhibitor im Medium war notwendig, um den 5-Me-dC Gehalt auf 72.2 % der Kontrolle zu senken. Bei einem Vergleich von Zebularin mit den neuen Derivaten ist allerdings zu beachten, dass diese Substanz nur dreimal zu den Zellen gegeben wurde, die übrigen Nukleoside (bis auf 5) jedoch viermal. Grund hierfür war die bei drei Anwendungen von 6 bereits deutlich sichtbare Hemmung des Zellwachstums. Es musste jedoch stets gewährleistet werden, dass

zum Zeitpunkt der Zelllyse noch genügend Zellen und damit eine ausreichende Menge zu extrahierender DNA zur Verfügung stand.

Die Versuche mit den in dieser Arbeit neu synthetisierten Substanzen verliefen enttäuschend. Zusammenfassend muss konstatiert werden, dass keiner der potentiellen Nukleosidinhibitoren einen nennenswerten Effekt auf die globale genomische DNA Methylierung von HCT116 Zellen zeigte. Im Rahmen der Fehlergrenzen blieb der Methylierungsgrad bei sämtlichen Nukleosiden unverändert, selbst bei millimolaren Inhibitorkonzentrationen Auch 2’-Desoxyzebularin (32) zeigte bei den eingesetzten Konzentrationen praktisch keine Wirkung. Abbildung 5.12 zeigt die lichtmikroskopischen Aufnahmen der Zellkulturen am Tag der DNA Extraktion für das neue Nukleosid 34 und die Referenzsubstanzen 5 und 6. Bereits bei 10facher Vergrößerung war ein deutlicher Unterschied hinsichtlich der Zelldichte zu erkennen:

Während das Bild bei 34 annähernd dem der Kontrolle entsprach, inhibierten 6 und vor allem 5 das Zellwachstum deutlich (obere Reihe; man beachte außerdem die unterschiedlichen Konzentrationen, siehe Abbildung 5.11).

Abbildung 5.12: Lichtmikroskopische Aufnahmen der HCT116 Zellen nach der Behandlung mit den Nukleosidinhibitoren; alle Zellen wurden an Tag 6 nach der Einsaat lysiert. Inkubationskonzentrationen und -zeiträume: 5: 2 µM, 2 d; 6: 1 mM, 3 d; 34: 1 mM, 4 d. Obere Reihe: Vergrößerung 10x; Untere Reihe:

Vergrößerung 50x; Pfeile: zerstörte Zellen.

In Übereinstimmung mit dieser Feststellung konnten bei Behandlung mit 34 auch keine morphologischen Veränderungen der Zellen beobachtet werden, im

Gegensatz zu den beiden bekannten Inhibitoren (untere Reihe). Sowohl bei Zugabe von 5-Aza-dC wie auch von Zebularin wurde ein Großteil der Zellen massiv geschädigt, wobei sich die betroffenen Zellen stark aufblähten, ihre klaren Konturen verloren und sich schließlich auflösten (Pfeile). Bei den übrigen, in Abbildung 5.12 nicht gezeigten Nukleosiden entsprach das Bild weitgehend dem der Kontrolle.

Das Zebularinderivat 34 wurde zusätzlich über einen verlängerten Zeitraum von zwei Wochen angewendet (ebenfalls in den Konzentrationen 20, 300 und 1000 mM), zeigte aber auch hier weder Veränderungen im globalen Methylierungsgehalt noch hinsichtlich der Zellmorphologie.

Wie für Desoxyzebularin in der Literatur bereits beschrieben, kann die Ursache für die Unwirksamkeit der Nukleoside zum einen in der metabolischen Verwertung in der Zelle und der mangelhaften Konvertierung zu den 5’-Triphosphaten liegen.^[300]

Zur Aufklärung des Metabolismus’ der Substanzen wären jedoch noch weitere Studien erforderlich. Zum anderen muss aber gerade in Verbindung mit den Ergebnissen der EMS Assays aus Kapitel 5.5.2 auch die grundsätzliche Funktionalität der potentiellen neuen Inhibitoren in Frage gestellt werden.

5.5.4 Auswirkungen der neuen Nukleoside auf die Zellproliferation von HCT116 Zellen

Parallel zu den Untersuchungen zur globalen genomischen DNA Methylierung wurde mittels des bereits beschriebenen WST Assays die Wirkung der Nukleoside auf die Zellproliferation ermittelt. Im Idealfall würden die Inhibitoren analog zu 5-Aza-dC in die genomische DNA integriert, wo sie DNMT1 kovalent binden und somit inhibieren würden. Durch die hiermit verbundene Demethylierung von Genpromotoren und die resultierende Re-Expression von Tumorsuppressorgenen sollten die Kontrollmechanismen der Zellen wieder greifen, die bei einem unkontrollierten Wachstum die Zellteilung stoppen und die Apoptose der Tumorzellen einleiten. Für HCT116 Zellen wurde bereits erfolgreich gezeigt, dass das Ausschalten bzw.

Inhibieren von DNMT1 ein verringertes Wachstum zur Folge hat.[9, 283, 288]

Für den Proliferationsassay wurden HCT116 Zellen in 96-well Platten (je 2500 Zellen pro well) für drei Tage mit Nukleosid-Konzentrationen von 20, 300 und 1000 µM

behandelt und am vierten Tag wurde die Zellviabilität bestimmt. Als Positivkontrolle dienten wie im vorigen Kapitel 5-Aza-dC behandelte Zellen, als Negativkontrolle wurde überhaupt kein Nukleosid zugesetzt. Die Ergebnisse sind auch hier prozentual in Bezug auf die Kontrollen angegeben, welchen der Wert 100 % zugewiesen wird.

Abbildung 5.13 gibt eine Übersicht über die Ergebnisse.

Hier zeigte sich nun ein differenzierteres Bild als bei den Untersuchungen zur globalen DNA Methylierung. Der als Positivkontrolle eingesetzte Inhibitor 5 inhibierte das Zellwachstum schon bei einer Konzentration von 2 µM deutlich, und zum Zeitpunkt der Messung waren verglichen mit der Kontrolle nur noch 44 % der Zellen voll funktionsfähig. Das einzige Cytidinderivat unter den neuen Nukleosiden, 6-CN-dC (29), zeigte zumindest einen schwachen Effekt und erniedrigte das Zellwachstum um knapp 20 %, allerdings erst bei einer Konzentration von 1 mM.

Drastisch wirkte sich hingegen die Anwendung von Zebularin (6) aus, wenn auch nur bei deutlich höheren Dosen verglichen mit 5-Aza-dC. Hier waren nach dreitägiger Einwirkung von 1 mM Nukleosid im Vergleich zur Kontrolle nur noch knapp 20 % der Zellen lebensfähig.

Abbildung 5.13: Auswirkung der neuen Nukleoside sowie der entsprechenden Referenzsubstanzen auf die Zellproliferation von HCT116 Darmtumorzellen. Die Zellen wurden über drei Tage mit 20, 300 und 1000 µM der neuen Substanzen inkubiert (Referenzsubstanzen 5 und 6 abweichend), und nach insgesamt vier Tagen wurde durch einen WST-1 Assay die Zellviabilität bestimmt. Der Wert für das Zellwachstum unbehandelter Zellen wurde

Von den übrigen Zebularinderivaten zeigte zwar keines eine vergleichbare Reduktion der Zellproliferation, dennoch konnten bei den Substanzen 32 und 34 durchaus nennenswerte Effekte beobachtet werden. Während 2’-Desoxyzebularin (32) das Wachstum bei 1 mM bereits auf 72 % erniedrigte, waren nach Anwendung des neuen Nukleosids 4-Me-dZeb (34) nur noch knapp 60 % der Zellen voll funktionsfähig. Bei den Nukleosiden 33, 35 und 36 konnten hingegen im Rahmen der Fehlergrenzen keine Auswirkungen auf die Zellproliferation festgestellt werden.

Man muss bei der Diskussion dieser Ergebnisse natürlich beachten, dass auf dem bisherigen Stand der Untersuchungen keine Aussagen über die Ursachen der inhibierenden Wirkung auf die Zellproliferation gemacht werden können. Während bei der Ermittlung des genomischen 5-Me-dC Gehalts eine recht spezifische Wechselwirkung betrachtet wird - nämlich die zwischen dem Nukleosid und der zellulären Methylierungsmaschinerie - sieht man bei einem Zellproliferationsassay die Wirkung der Substanzen auf eine große Vielzahl an Signalwegen. Als ein Beispiel eines Wirkungsmechanismus neben der DNA Methylierung sei hier nur der bekannte inhibierende Effekt von Zebularin auf Cytidindeaminasen genannt. Auf welche Art ein Stoff das Zellwachstum letztendlich hemmt, kann in der Regel nur durch aufwändige Studien geklärt werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen jedoch, dass einige der synthetisierten Substanzen biologisch aktiv sind und in zelluläre Mechanismen eingreifen können.