Auswertung der histologischen Schnitte

4.5.1.1 Infiltration mit heterophilen Granulozyten

Zur Bestimmung des Ausprägungsgrads einer Infiltration mit heterophilen Granulozyten wurden diese in die Grade von 1 bis 7 eingeteilt (Tab. 7).

Tabelle 7: Einteilung der Ausprägungsgrade der Infiltrationen.

Grad Optisch bewertete Anzahl (auf dem Präparat)

Grad 1 vereinzelt

Grad 2 vereinzelt-geringgradig

Grad 3 geringgradig

Grad 4 geringgradig-mittelgradig

Grad 5 mittelgradig

Grad 6 mittelgradig-hochgradig

Grad 7 hochgradig

Bei der Gesamtbewertung wurde wie folgt vorgegangen:

Das Ausmaß der Infiltration einer Probe mit Immunzellen ist ein Produkt aus den Befunden

„Ausprägungsdichte“ (s.o. – mit Grad 1 bis 7) und anteiliges Vorkommen in der Probe (als prozentuale Angabe). Das so ermittelte Ergebnis erlaubt demnach eine Aussage darüber, wie viel Prozent des Schnittes mit den entsprechenden Zellen in welchem Grad infiltriert war. Bei dieser Berechnungsweise kommen jedoch rein mathematisch auch Zahlen mit einer Kommastelle vor, da es sich um eine einfache Multiplikation aus zwei Faktoren (Ausprägungsdichte und relative Vorkommenshäufigkeit in der Probe) handelt.

Um die Kategorien besser darstellen zu können, wurden alle Ergebnisse gleichermaßen mit dem Faktor 10 multipliziert, um auf diese Weise gerade Zahlen zu erhalten. So entstehen Kategorien von 1 bis maximal 70. Die Kategorie 70 steht also für eine Probe mit einem flächigen Vorkommen von Immunzellen (=100%) in maximaler Dichte (Grad 7); ein Beispiel zeigt die Abbildung 3.

Methoden

Abbildung 3: Heterophile Granulozyten (interfollikulär) (HE-Färbung; Halshaut);

Tier B2K3 gemäß Tabelle 10.3.3

4.5.1.2 Vorkommen von Lymphozyten

Alle Proben wurden mit Ausnahme des den Darm umgebenden Peritoneums auf das Vorhandensein von Lymphozyten untersucht. Die Bestimmung des Ausprägungsgrads eines diffusen Vorkommens mit Lymphozyten war identisch mit der Einteilung von heterophilen Granulozyten (s. 4.5.1.1). Bei Lymphoyzyten wurde zusätzlich erfasst, in welchem Verteilungsmuster diffuse Anordnung (Abb. 4), Anordnung als Gruppen (als intermediärer Zustand zwischen diffuser und follikulärer Anordnung, Abb.

5) oder in follikulärer Anordnung (Abb. 6, 7) diese in der jeweiligen Gewebeprobe vorlagen.

Methoden

Abbildung 4: Lymphozyten in diffuser Verteilung (HE-Färbung; Caecum);

Tier B3K2 gemäß Tabelle 10.3.3

Abbildung 5: Lymphozyten in Verteilung in Gruppen (HE-Färbung; Brusthaut);

Tier B1K5 gemäß Tabelle 10.3.3

Methoden

Abbildung 6: Lymphozytenvorkommen in breiter Zotte mit zusätzlich Lymphozyten in follikulärer Anordnung (HE-Färbung; Duodenum); Tier B2G4 gemäß Tabelle 10.3.3

Abbildung 7: Lymphozyten in follikulärer Anordnung (HE-Färbung, Duodenum);

Tier B6G3 gemäß Tabelle 10.3.3

Methoden

Bei Lymphozyten, die sich im Präparat in Gruppenanordnung oder in follikulärer Anordnung (Darmgewebe) zeigten, musste aufgrund der fokalen Verdichtung eine andere Einteilung vorgenommen werden als bei deren Vorkommen in diffuser Verteilung. Dazu wurde zunächst ermittelt, wie viele Gruppen bzw. „Follikel“ in der jeweiligen Probe nachweisbar waren. Als zweiter Faktor kam die Größe der Gruppe bzw. des „Follikels“ hinzu. Die Größe der Gruppen bzw. der „Follikel“ wurde in vier Graden eingestuft (Tab. 8). Abbildungen 8 bis 11 zeigen unterschiedlich große Lymphozytenvorkommen in der Haut der Kloake bei einer Gefieder ⊖ Pute.

Tabelle 8: Gradeinteilung für lymphatische Einrichtungen, die in Gruppen bzw. "Follikel"

vorlagen

Grad Optisch bewertete Größe (im Verhältnis zum Mikroskop-Sichtfeld)

Grad 1 klein

Grad 2 mittel

Grad 3 groß

Grad 4 sehr groß

Aus diesen beiden Faktoren ergibt sich folgende Gesamtbewertung: Zur Ermittlung des Ausprägungsgrades in einer Probe mit Immunzellen, die nicht diffus verteilt waren, sondern in Gruppen oder in follikulärer Anordnung vorlagen, wurden die jeweils in einem histologischen Präparat nachweisbaren „Lymphfollikel“ oder Gruppenanordnung gezählt und mit dem jeweiligen Umfang der aggregierten Lymphozyten-Ansammlung – eingeteilt in die Kategorien 1 bis 4 - multipliziert. War die Größe der Gruppenanordnung bzw. des „Follikels“ in einem Präparat jeweils unterschiedlich, ging dies exakt so mit der jeweiligen unterschiedlichen Gewichtung in die Berechnung ein. Eine Korrektur der so ermittelten Werte um den Zahlenfaktor 10 (wie bei der Berechnung der Ausprägung bei diffusem Vorkommen aus Gründen der besseren Darstellbarkeit so vorgesehen) war hier nicht nötig, weil durch dieses Berechnungsverfahren stets nur ganze Zahlen herauskamen. Dadurch ergaben sich in einigen Proben sehr hohe Zahlenwerte; dies hatte jedoch den Vorteil, dass durch die so besonders deutlich werdende Binnendifferenzierung in den Vorkommensgraden – auf die es in dieser vergleichenden Betrachtung ankam – eine bessere Vergleichbarkeit der einzelnen Puten untereinander möglich ist.

Aus methodischen Gründen wurde bei den Untersuchungen der perifollikulären Abschnitte der Haut auf das Vorhandensein von Lymphozyten darauf verzichtet, deren Anordnung (diffus, in Gruppenanordnung, Anordnung in Follikeln) differenziert auszuwerten; es wurde lediglich eine qualitative Bewertung vorgenommen.

Methoden

Abbildung 8: Grad 1 der Beurteilung der Lymphozytenvorkommen, sofern Lymphozyten in Gruppen bzw. Follikeln vorlagen (HE-Färbung; Kloakenschleimhaut);

Tier B1K3 gemäß Tabelle 10.3.3

Abbildung 9: Grad 2 der Beurteilung der Lymphozytenvorkommen, sofern Lymphozyten in Gruppen bzw. Follikeln vorlagen (HE-Färbung; Kloakenschleimhaut);

Tier B1K3 gemäß Tabelle 10.3.3

Methoden

Abbildung 10: Grad 3 der Beurteilung der Lymphozytenvorkommen, sofern Lymphozyten in Gruppen bzw. Follikeln vorlagen (HE-Färbung; Kloakenschleimhaut);

Tier B1K3 gemäß Tabelle 10.3.3

Abbildung 11: Grad 4 der Beurteilung der Lymphozytenvorkommen, sofern Lymphozyten in Gruppen bzw. Follikeln vorlagen (HE-Färbung, Kloakenschleimhaut);

Tier B4G3 gemäß Tabelle 10.3.3

Methoden

4.5.1.3 Dermale Umgebung der Federfollikel

Um zu untersuchen, inwieweit entzündliche oder sonst histologisch befundbare Veränderungen der Haut auch in der dermalen Umgebung von Federfollikeln vorhanden sind, wurde diese histologisch ausgewertet. Es wurden nur die Hautstellen von Schulter, Hals, Brust und Kloake-Haut ausgewertet, da nur an diesen Stellen ein auswertbarer Anteil an Befiederung vorkam. Von den jeweiligen Hautproben wurden nur solche Präparate ausgewertet, welche mindestens einen Federfollikel beinhalteten; einige Schnitte enthielten keine Federfollikel, da die Proben an den jeweiligen Hautstellen zufällig genommen wurden. Allerdings ist jedes Tier mit mindestens einer Hautprobe in die Auswertung eingegangen, da sämtliche Tiere mindestens einen Federfollikel an der Schulter aufwiesen. Speziell sind für die Gruppe der Gefieder ⊕ Tiere für die Hautstelle „Schulter“ 40 Tiere, 18 Tiere für die Hautstelle „Hals“, 34 Tiere für die Hautstelle „Brust“ und 6 Tiere für die Hautstelle „Kloake-Haut“ in die Auswertung eingegangen.

Für die Gruppe Gefieder ⊖ Tiere waren dies 40 Tiere für die Hautstelle „Schulter“, 21 Tiere für die Hautstelle „Hals“, 32 Tiere für die Hautstelle „Brust“ und 7 Tiere für die Hautstelle „Kloake-Haut“.

Bei der Bewertung der perifollikulären Hautabschnitte wurde hinsichtlich der Auswertung keine zellartspezifische Differenzierung vorgenommen, sondern nur summarisch in Betracht gezogen, inwieweit Immunzellen vom Typ heterophile Granulozyten, Lymphozyten, Blutungen oder Hyperkeratosen vorkamen. Bereits der einzelne Nachweis von heterophilen Granulozyten, von Lymphozyten, von Blutungen oder von Hyperkeratosen wurde als „histologisch abweichend“ eingestuft.

4.5.1.4 Pankreas

Bei der histologischen Untersuchung von Proben aus dem Duodenum ergaben sich bei dem daran jeweils anhaftendem Pankreasgewebe spontan Hinweise darauf, dass diese vielfach in einem auffälligen Zustand erschienen. Es bot sich daher an, auch die Pankreata in der histologischen Gesamtauswertung aller Organbefunde mit einzubeziehen, wenngleich die Untersuchung von Pankreasgewebe nicht ausdrücklich Gegenstand der Arbeit war.

Dazu wurde das Vorkommen von Lymphozyten in follikulärer Anordnung mit deren Ausprägungsgrad gewichtet (scoring), indem der Ausprägungsgrad jeder einzelnen Lymphozyten-Gruppe pro Schnitt aufsummiert wurde. So konnte z.B. ein Schnitt drei Lymphozyten-„Follikel“ erhalten, die jeweils einen leichten Ausprägungsgrad von 1 hatten, sodass sich eine Summe von 3 ergab; ebenso konnte eine Summe von 3 erreicht werden, wenn nur zwei Lymphozyten-Gruppen vorlagen, welchen einen leichten Grad von 1 und einen mittleren Grad von 2 aufwiesen.

4.5.1.5 „Branching“ der Krypten im Darm

Die Darmschleimhaut ist ein sehr reaktives Gewebe und spiegelt in besonderer Weise Entzündungsprozesse wider. Beim Schwein wurde experimentell nachgewiesen (TUCH und AMTSBERG 1973), dass es bei länger anhaltenden chronischen Schleimhautentzündungen zu einer proliferativen Verzweigung in den Darmkrypten kommen kann. Zudem ist bei Broilern bekannt, dass es fütterungsbedingt zu histologischen Veränderungen in der Textur des Darms kommen kann (KALMENDAL et al. 2011).

Methoden

Um zu überprüfen, inwieweit dieses möglicherweise auch bei der Pute der Fall ist und möglicherweise auch die Krypten betroffen sein könnten, wurde bei allen 80 Puten gesondert für jeden der drei Darmabschnitte (Duodenum, Jenunoileum, Caecum) die jeweilige Schleimhaut auf deren morphologische Beschaffenheit histologisch überprüft (Abb. 12). Dabei fiel auf, dass bei den untersuchten Puten die Krypten proliferativ verzweigt waren, im Folgenden „Branching“ genannt. Zur Auswertung dieser Veränderungen wurde ermittelt, in welchem prozentualen Anteil die Krypten verzweigt waren.

Beim positiven Nachweis von Branching-Prozessen als solche wurden die Befunde hinsichtlich der Häufigkeitsverteilung in Prozent-Kategorien von 0% bis 100% eingeteilt.

Abbildung 12: Branching der Krypten (HE-Färbung; Duodenum);

Tier B1K3 gemäß Tabelle 10.3.3

Methoden