Auswärts gerichtete Stöme

Aufgrund von Unterschieden der Ströme intravital markierter Neurone aus Primär-kulturen von Ch. biguttulus wurden die abgeleiteten Neurone im Ergebnisteil 3.3 in zwei Klassen unterteilt. Als Kriterium zur Unterteilung der beiden Neuronenklassen wurde eine deutliche Abweichung in der Strom/Spannungsrelation des Auswärtss-troms bei hohen Klemmspannungen herangezogen. Es konnten zusätzlich signikante Unterschiede in der Gesamtstromstärke des Auswärtsstroms und in dem Verhältnis von transientem zu persistierendem Strom festgestellt werden.

Der gemessene Auswärtsstrom von Neuronen des Typs B konnte in Komponenten zerlegt werden, die wahrscheinlich von Kaliumkanälen des Typs Kdr und KA getra-gen werden. Die getra-genaue Charakterisierung dieser Kanäle anhand ihres

pharmakolo-mit elektrophysiologischen Methoden jedoch genrell schwer zu verizieren und an-hand der geringen Datenmenge dieser Arbeit viel zu spekulativ und müsste durch Perforated Patch Clamp Ableitungen untersucht werden.

Der Auswärtsstrom der Neurone des Typs B wird ebenfalls sehr wahrscheinlich von Kaliumkanälen des Typs Kdr und KA getragen, zeigt jedoch wie in Abb. 3.35B gut ersichtlich, ab einer angelegten Spannung von−20 mVeinen N-Förmigen Verlauf der Strom/Spannungsrelation. Diese Form ist typisch für die Strom/Spannungskurve ei-nes kalziumabhängigen Kaliumkanals und wurde erstmals von Heyer und Lux (1976) bei Schrittmacherneuronen von Helix pomatia beschrieben. Singh und Wu (1989) be-schreiben zwei Typen kalziumaktivierter Kaliumkanäle im Muskel von Drosophila.

Durch spezische Antagonisten können die beiden Typen kalziumaktivierter Kali-umkanäle eindeutig unterschieden werden. Der schnelle transiente kalziumaktivierte Strom ICF kann durch ein Peptid des Skorpiongiftes (Charybdotoxin) und der lang-sam inaktivierende Strom ICS durch eine Komponente des Bienengiftes (Apamin) geblockt werden. Eine genaue Dierenzierung zwischen diesen Kanaltypen durch das Einwaschen selektiver Blocker war Aufgrund der in 3.3.3 beschrieben Proble-matik der relativ instabilen Whole-Cell-Konguration bei meinen Untersuchungen nicht möglich. Ein kalziumaktivierter Kaliumkanal wurde ebenfalls von Schäfer et al.

(1994) in Kenyonzellen der Honigbiene beschrieben, doch auch hier war eine eindeu-tige Zuordnung des kalziumaktivierten Stroms zu einem bestimmten Kanaltyp nicht möglich, weil der charakteristische N-förmige Verlauf der Stromspannungkurve be-reits wenige Minuten nach Etablierung der Wohle-Cell-Konguration verschwand.

Blockexperimente mit Charybdotoxin lieferten hier keine eindeutigen Ergebnisse, da scheinbar auch Kdr Kanäle durch das Toxin blockiert wurden.

Die in den intravital markierten Neuronen aus dem Gehirn Chorthippus biguttu-lus detektierten Kaliumkanaltypen konnten in primärkultivierten Hirnneuronen ver-schiedener Insektenspezies nachgewiesen werden (Wegener et al. (1992) bei Locusta, Zufall et al. (1991) bei Manduca sexta, Grünewald (2002) bei Apis mellifera, Cayre et al. (1998) bei Grillen und Wright und Zhong (1995) bei Drosophila). Unterschied-liche Neuronentypen exprimieren unterschiedUnterschied-liche Kombinationen von Kaliumkanä-len (Beadle 2006). So exprimieren Projektionsneurone des Antennallobus der Biene zwar Kdr- und einen Typ kalziumaktivierter Kaliumkanäle, jedoch keine KA-Kanäle (Grünewald 2002). Die meisten Erkenntnisse über Hirnneurone von Insekten

wur-umkanäle, die auch in meiner Arbeit in intravtial markierten Neuronen des Typs A gefunden wurden. Die Arbeiten von Pelz et al. (1999), Grünewald (2002) und Wüs-tenberg et al. (2004) an Bienen belegen lediglich die Experession von K_dr und K_A Kanälen in Kenyonzellen. Diese Diskrepanz der an Kenyonzellen von Bienen durch-geführten Untersuchungen könnte durch unterschiedliche Kulturbedingungen oder durch unterschiedliches Alter der verwendeten Puppenstadien begründet sein. Die Ergebnisse von Schäfer et al. (1994) waren in Folgeexperimenten teilweise nicht mehr reproduzierbar (persönliche Korrespondenz mit B. Grünewald). Auch in Drosophila wurden nur Kdr und KA Kanäle in den selben Neuronen detektiert (Wright und Zhong 1995). Die von Cayre et al. (1998) untersuchten Neurone der Pilzkörper von Grillen exprimierten kalziumabhänige Kaliumkanäle und Kdr, jedoch zeigten die ge-ringen transienten Auswärtsströme vom Typ IA, im Gegensatz zu den Kenyonzellen der Honigbiene, keine Sensitivität zu dem selektiven KA Blocker Quinidine. Somit scheint der IA der Kenyonzellen bei Grillen von einem anderen Kanaltyp getragen zu werden als bei Bienen.

Die Kombination verschiedener Kaliumkanäle scheint also nicht nur vom generel-len Neuronentyp abhängig zu sein, sondern unterscheidet sich, wie am Beispiel der Kenyonzellen beschrieben, auch zwischen verschiedenen Insektenarten und Entwick-lungsstadien. Patch-Clamp Untersuchungen von protocerebralen Zellen der Heu-schrecke liegen als Vergleich zu den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Ex-perimenten nicht vor. Elekrophysiologische Untersuchungen mit der Patch Clamp Technik an Heuschrecken wurden bisher überwiegend an thorakalen Neuronen und antennalen Rezeptorzellen durchgeführt (Laurent 1991, Heidel und Püger 2006, Wegener et al. 1992). Festzuhalten bleibt, dass die intravital markierten Neuro-ne unterschiedliche KaliumkanalpopulatioNeuro-nen aufweisen. Ob diese Unterschiede mit verschiedenen Funktionen im Gesangsverhalten assoziiert sind oder ihre Ursache in einer eventuellen Fehlmarkierung haben lässt sich nicht eindeutig feststellen. Eine intravital markierte Zelle während der Applikation von Muskarin gleichzeitig elek-trophysiologisch und optisch abzuleiten, war nicht erfolgreich. Somit können die elektophysiologischen Erkenntnisse bezüglich der exprimierten Kaliumkanäle nicht eindeutig mit den Ergebnissen der Kalziumimaging Experimente verknüpft werden.

Die Detektion der Kaliumkanaltypen Kdr, KA und KCa in einem Zelltyp (wie bei Neuronen des Typ A) ist jedoch ungewöhnlich und könnte auf eine funkionelle

Be-auswärtsgerichtete Ströme in Kenyonzellen der Biene zu blocken, wurden 20 mM TEA der Extrazellulärlösung zugegeben und zusätzlich das Kalium in der Pipetten-lösung gegen Cäsium ausgetauscht (Grünewald 2002). Schäfer et al. (1994) konnten durch Einwaschen von20 mMTEA eine60 %ige Reduktion des persistierenden Aus-wärtsstroms der Kenyonzellen von Bienen feststellen. Auch Byerly und Leung (1988) beobachteten bei embryonalen Neuronen von Drosophila nach dem Einwaschen von 10 mM TEA eine Reduktion der persistierenden Komponente des Auswärtsstroms.

Die gemessene maximale Amplitude der in Abbildung 3.31 dargestellten Ableitung liegt mit7,26 nAim Vergleich zu den gemittelten Stromstärken der in anderen Prä-parationen abgeleiteten Neurone (Abb. 3.28) sehr hoch. Da die persistierende Kom-ponente des Auswärtsstroms einen groÿen Teil des Gesamtauswärtsstroms trägt, ist es unwahrscheinlich, dass diese Komponente durch TEA geblockt wurde. Die Zelle zeigt jedoch, im Gegensatz zu den übrigen Ableitungen intravital markierter Neuro-ne, so gut wie keine transiente Komponente in ihrem Auswärtsstrom. Das Blocken der transienten Komponente des Auswärtsstroms stände jedoch im Widerspruch, zu den an anderen Insekten gewonnen Erkenntnissen. Die von Cayre et al. (1998) untersuchten Kenyonzellen der Grillen zeigten beispielsweise erst nach Einwaschen hoher Konzentrationen TEA (100 mM) überhaupt eine transiente Komponente ihres Auswärtsstroms. Anhand eines einzigen Experimentes lässt sich jedoch keine klare Aussage bezüglich der geblockten Komponenten des Auswärtsstroms treen. Für einen vollständigen Block des kaliumgetragenen Stroms bei Feldheuschrecken reicht jedoch die Zugabe von TEA allein nicht aus. Heidel und Püger (2006) zeigten, dass die Blockierung des kaliumgetragenen Stroms der DUM-Neurone von Schistocerca gregaria erst mit einer speziell angepassten Bad- und Pipettenlösung möglich war.

Schäfer et al. (1994) und Cayre et al. (1998) beschreiben das Phänomen, dass ein-wärts gerichtete Ströme erst nach dem partiellen oder vollständigen Block der Aus-wärtsströme detektiert werden können. Aufgrund der schnellen Inaktivierung und der Strom/Spannungsrelation des Einwärtsstroms handelt es sich hierbei sehr wahr-scheinlich um einen von Na⁺-Ionen getragenen Strom. Absolute Sicherheit wäre erst nach erfolgreichem Block mit Tetrodotoxin gewährleistet. Nahezu alle Untersuchten Hirnneurone von Insekten zeigten einen langsam inaktivierenden, von Ca²⁺-Ionen getragenen Einwärtsstrom (Beadle 2006). Evidenzen für einen solchen Strom wur-den in wur-den Ableitungen intravital markierter Neurone nicht gefunwur-den. Dies ist

wahr-Püger 2006), könnte dies ein für Heuschreckenneurone typisches Merkmal sein.