Ausgangssituation dieser Arbeit

Identifizierung von Eferin als Bindepartner von RanGAP1 im yeast two hybrid

In einer yeast two hybrid-Interaktionsanalyse wurde mit der säugerspezifischen, c-terminalen Domäne von RanGAP1 (aus Mus musculus) nach möglichen Binde-partnern Ausschau gehalten (Abb. M). Die Hoffnung lag dabei auf der Identifikation neuer Zielproteine für die Sumoylierung durch Ubc9 und RanBP2 bzw. neuer Binde-partner zur Regulation des RanGTPase-Zyklus.

Vertebraten

Abbildung M: Vergleich der Domänenorganisation des RanGAP ausgewählter Vertreter Alle Organismen weisen eine auffällige Konservierung der katalytischen Domäne und des daran an-schließenden sauren Bereichs auf [³⁹]; die Struktur der katalytischen Domäne des GAP aus Hillig et al.

[⁸¹]; im Gegensatz zu Hefen weist das GAP in Pflanzen und Vertebraten eine eigene Verankerungs-domäne auf, die in Vertebraten zur Verankerung sumoyliert werden muss.

In dieser Analyse wurde Ubc9 als bereits bekannter Bindepartner von RanGAP1 bestätigt und ein neuer, bislang spärlich beschriebener, Interaktionspartner mit Namen Eferin (als cDNA-Klon KIAA 0665 genannt [⁸²]) gefunden. Die für diese Inter-aktion in RanGAP1 und Eferin nötigen Bindedomänen wurden von mir während der Diplomarbeit kartiert (siehe Abb. N; vergleiche Abb. O: grau unterlegte Domäne

= GAP BD) [⁸³]. Dabei zeigte sich, dass für die Wechselwirkung mit Eferin weder die Sumoylierung noch die Phosphorylierung von RanGAP1 an den bekannten Modifi-kationsstellen nötig ist.

456 Eferin-Bindedomäne 589

471 Ubc9-Bindedomäne 589

400 589

526 411 430 444

K

SUMO1

T S S

456 Eferin-Bindedomäne 589

RanGAP1 (C-Terminus)

Abbildung N: Interaktionsdomänen in RanGAP1

Darstellung der minimalen Domäne von RanGAP1 (Mus musculus), die für die Interaktion mit Eferin und Ubc9 nötig ist [⁶⁰]. Im C-Terminus von RanGAP1 sind die Positionen der posttranslationalen Modifikationen [^{84, 85}] hervorgehoben ohne, dass diese für die jeweilige Interaktion von Nöten wären;

modifizierte Abb. aus Kiendl [⁸³].

Eferin

Eferin steht als Akronym für EF-Hand containing Rab11 interacting protein. Damit wird der Fähigkeit Rechnung getragen mit Rab11 interagieren (und mittels EF-Hand-Motiv Ca²⁺ binden) zu können [⁸⁶]. Weil neben Eferin mittlerweile fünf weitere, ein-ander ähnliche Bindepartner von Rab11 identifiziert wurden, konnte daraus eine Familie Rab11-interagierender Proteine gebildet werden [^86-89]. Grundeigenschaft dieser Familienmitglieder ist allein die Rab11-Bindedomäne (= Rab11 binding

P P P

471 Ubc9-Bindedomäne 589

400 589

526 411 430 444

RanGAP1 (C-Terminus)

T S S K

P P P

SUMO1

domain = RBD) [⁸⁶]. Da Eferin das dritte Mitglied dieser Familie wurde, erhielt es den synonymen Namen Rab11-FIP3 (Rab11 family of interacting protein member #3) und wurde wegen der nahen Verwandtschaft zu Rab11-FIP4 mit diesem einer eigenen Unterklasse zugeteilt [^{89, 90}]. Aufgrund der beschriebenen Wechselwirkung von Eferin und Rab11-FIP4 mit den GTPasen ARF 4, 5 und 6, wurde Eferin synonym

Arfophilin1 und Rab11-FIP4 entsprechend Arfophilin2 genannt [^91-93].

Domänenstruktur

Innerhalb des C-Terminus von Eferin befinden sich sowohl Rab11-, ARF- als auch die RanGAP1-Bindedomäne [^{83, 86, 92}]. Wie die Kartierungsergebnisse verdeutlichen (siehe Abb. O), überlappt die RanGAP1-Interaktionsdomäne (= GAP BD) nicht nur mit der ARF-Bindedomäne (= ARF BD), sondern auch mit der zweigeteilten coiled coil Domäne [^{89, 92}]. Diese wird als Protein-Protein-Wechselwirkungsdomäne ange-sehen und zur Homo- und Heterodimerisierung genutzt [⁸⁹]. Das EF-Hand-Motiv wurden bereits als Ca²⁺-Bindemotiv angesprochen. Daneben kann im Aminoterminus eine Prolin-reiche Domäne ausgemacht werden [^{87, 90, 92}], die eine sogenannte PEST-Sequenz enthält, welche ihrerseits mit Proteinabbau in Verbindung gebracht wird [⁹⁴].

Homologie

Als Homolog zu Eferin (und Rab11-FIP4) wurde in Drosophila melanogaster das Genprodukt Nuf (= nuclear fallout) ausgemacht [⁹⁵]. Die Homologie zwischen Nuf und Eferin (und Rab11-FIP4) beschränkt sich im Wesentlichen auf den C-Terminus mit angenommenem coiled coil Bereich (Abb. O) [⁹¹]. Während früher Entwicklungs-stadien bei Drosophila melanogaster trägt Nuf durch Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts und durch Wechselwirkung mit Rab11 letztlich entscheidend zur Bildung der Teilungsfurche bei [^96-98]. In diesem Zusammenhang ist eine Besonderheit von Nuf während der Mitose bemerkenswert. In Interphase befindet sich Nuf im Zyto-plasma und reichert sich in Prophase an den Centrosomen an [⁹⁹]. Da Nuf durch diese Lokalisation andere Proteine zur Teilungsfurche steuert, wurde bereits früh spekuliert, dass es dazu diene, Vesikel für die Bildung der Teilungsfurche auf die mitotischen Mikrotubuli zu laden [⁹⁷].

nuclear fallout:

502

coiled coil Actin interacting protein 3Domäne

1

coiled coil

756

Prolin-reiche Domäne EF EF

549 Actin interacting protein 3Domäne

1

coiled coil

756

Prolin-reiche Domäne EF EF

549

Abbildung O: Organisationsstruktur von nuclear fallout (= Nuf) und Eferin

Vorhergesagte oder beschriebene Domänen in Nuf und Eferin (EF = EF-Hand-Motiv; BD = ARF-Bindedomäne; RBD = Rab11-ARF-Bindedomäne; GAP-BD = RanGAP1-Bindedomäne); modifizierte Abb.

aus Kiendl [⁸³].

Mögliche Funktion in Interphase und Mitose

Besonders gut untersucht ist die Interaktion von Eferin mit Rab11. Die GTPase Rab11 selbst gilt als Marker für recyclisierende Endosomen [¹⁰⁰], welche die Rück-führung endozytierter Plasmamembran über Vesikeltransport in die Wege leitet. Da endosomale Vesikel als Membranreservoir für die Bildung der Teilungsfurche in Zyto-kinese dienen könnten [¹⁰¹], wurde spekuliert, dass Eferin und Rab11 an diesem Prozess zur Bildung der Teilungsfurche beteiligt sind. Diese Hypothese wird auch dadurch gestützt, dass bei Drosophila Nuf und Rab11 in diesem Prozess involviert sind [⁹⁶]. Für Eferin war bis zu Beginn dieser Arbeit lediglich eine Rab11-abhängige Lokalisation an den recyclisierenden Endosomen beschrieben [^{87, 90}]. Wie

Vor-arbeiten von Dr. Andreas Gast zur Lokalisation von Eferin bislang zeigten, konnte Eferin nur in mitotischen Zellen und in diesen nur an den Centrosomen detektiert werden. Diese mitotische Lokalisation von Eferin überschnitt sich wiederum mit der berichteten centrosomalen Lokalisation von Nuf in Drosophila [⁹⁹].

Aufgabenstellungen

Ziel dieser Arbeit sollte zunächst sein, die im yeast two hybrid gefundene Interaktion zwischen RanGAP1 und Eferin in vivo (in Säugerzellen) zu bestätigen und die funk-tionelle Konsequenz dieser Interaktion zu untersuchen. Wie Ergebnisse der Kartie-rung der Interaktionsdomänen nahelegen (siehe Abb. N), sollte insbesondere über-prüft werden, ob Ubc9 als möglicher Überbrückungsfaktor (= bridging factor) für die Interaktion zwischen RanGAP1 und Eferin fungiert. Des Weiteren sollte, da sich für Eferin in Mitose eine centrosomale Lokalisation gezeigt hatte, diese genauer unter-sucht und anschließend geklärt werden, wie eine mitotische Anreicherung von Eferin an Centrosomen zu Stande kommt.