Ausblick

Es konnten über 53 Proteine als hochreguliert in der vergleichenden Proteomik identifiziert werden. Von vielen ist der in den Datenbanken angegebene N-Terminus lediglich postuliert und somit nicht validiert. Weiterführend sollten also diese Proteine hinsichtlich ihres Potentials als Substrat des Proteinabbauweges näher betrachtet werden. Berücksichtigt man die Tatsache dass sowohl ate1 ate2 als auch prt6-Pflanzen einen sichtbar veränderten Phänotyp unter Kurztagbedingungen im Vergleich zum Wildtyp zeigen, so wäre es durchaus sinnvoll DIGE- und Shotgun-Experimente mit Pflanzen, welche unter diesen Bedingungen angezogen wurden, durchzuführen. Auch sollten Mutanten wie ntan1, ntaq1 und Tripelmutanten ate1 ate2 prt6 mit einbezogen werden. Ein anderer experimenteller Ansatz wäre, diese Genotypen unter verschiedenen Stressen proteomisch zu vergleichen. Anbieten würde sich hier in einem ersten Experiment der Vergleich unter Wasserstress. Hier sollten als Positivkontrolle die Proteine der ERFVII als stabilisiert in den Mutanten auftreten.

Da die in vitro und in vivo Ergebnisse zu RIN4 widersprüchlich hinsichtlich seiner Rolle als N-end rule pathway-Substrat sind, wäre es angebracht diese Stabilitätsuntersuchungen in vivo auch noch einmal mit den anderen Varianten X-RIN411-152:YFP (X = D, RD, G) in Mesophyllprotoplasten von Col-0, ate1 ate2 und prt6-1 durchzuführen. Auch sollte das Vollängenprotein hinsichtlich seiner Stabilität in diesen Genotypen untersucht werden. Des Weiteren gäbe es die Möglichkeit RIN4 in induzierbaren Linien mit der pathogenen Protease AvrRpt2 zu untersuchen. Dazu müsste das Konstrukt in die Mutanten des N-end rule pathways gekreuzt werden und nach Induktion der Protease müsste man dann die Abundanz des endogenen RIN4 über eine bestimmte Zeit verfolgen. Es wäre zu erwarten, dass RIN4 im Wildtyp schneller abgebaut wird als in den Mutanten-Linien. Des Weiteren sollte die Deamidase NTAN1 rekombinant aktiv exprimiert werden, um mit diesem Enzym die Umwandlung von N-RIN4 zu D-RIN4 zu untersuchen. Die Arginylierung durch die ATE1 konnte in vitro gezeigt werden, allerdings sollte dies auch in vivo nachgewiesen werden.

Hierzu müsste man Überexpressionslinien von N-RIN4 in prt6 erzeugen und nachfolgend das Protein mittels des C-terminalen YFPs isolieren, um dann den N-Terminus mit Hilfe der ChaFRADIC-Methode als arginyliert nachzuweisen.

Die bisher durchgeführten Experimente zur Charakterisierung von TGG2 als Substrat des N-end rule pathways zeigen keinen N-terminal abhängigen Abbau des Proteins. Zur weiteren Klärung sollten TUBE-Versuche analog zu den bereits für RD21a beschriebenen durchgeführt werden. Hierbei könnte man einen genaueren Einblick in die in vivo Ubiquitinylierung des Proteins bekommen. Zudem sollte man auch die Transkriptmenge von TGG2 in dem eingesetzten Pflanzenmaterial in DIGE und Shotgun überprüfen. Eventuell

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handelt es sich bei der Hochregulation in der vergleichenden Proteomik nicht um eine Stabilisierung auf Proteinebene, sondern um eine erhöhte Transkription, welche durch die Stabilisierung eines Tfs zustande kommt. Ein in vitro Ubiquitinylierungsversuch mit rekombinantem PRT6 würde Klarheit geben, ob K-TGG2 ein Substrat der E3-Ligase darstellt und ob PRT6 tatsächlich diese Funktion erfüllt. Dazu müsste die E3-Ligase gereinigt werden. Sollte TGG2 dennoch ein Substrat des N-end rule sein, so müssten ate1 ate2 und prt6 einen myrosinaseabhängigen veränderten Phänotyp zeigen. Zur Reduktion der redundanten Funktion von TGG1 sollten zuvor tgg1 ate1 ate2 sowie tgg1 prt6-Knockoutmutanten gekreuzt werden.

Aufgrund der in dieser Arbeit erzeugten Daten, kann gesagt werden, dass es sich bei RD21a um das erste nachgewiesene pflanzliche Substrat des N-end rule pathways handelt, welches nicht mit MC beginnt. Da die Stabilitätsuntersuchungen des Vollängenfusionsproteins RD21a:YFP in vivo nicht eindeutig waren, wäre es nötig, dieses Protein unter einem schwächeren Promotor zu untersuchen. Auch wäre der Nachweis des arginylierten RD21a-Fragments in vivo der finale Beweis dass es sich um ein Substrat des Abbauweges handelt.

Hierzu gibt es zwei Möglichkeiten. Zum Einen kann man D-RD21a:YFP in Protoplasten von prt6-1 exprimieren, über eine GFP-Trap reinigen und anschließend zur MS-Analyse verwenden. Die andere Möglichkeit besteht darin, das endogene RD21a aus prt6-Mutanten mittels DCG-04 zu markieren und dann anhand der Sonde aus dem Material isolieren, um es danach einer massenspektrometrischen Analyse zuzuführen. Das arginylierte Protein sollte identifiziert werden können, da es nicht durch PRT6 abgebaut werden sollte und zudem in dieser Mutante höher abundant ist. Die erhöhte Abundanz der Cysteinprotease sollte sich auch in einem sichtbar veränderten Phänotyp widerspiegeln. Bisher waren die durchgeführten Experimente nicht erfolgreich. Daher wäre es sinnvoll, weitere biotische (zum Beispiel streng biotrophe Pathogene) und abiotische (Starklicht, Zuckermangel) Situationen zu testen, um einen Effekt, welcher auf RD21a zurückzuführen ist, zu beschreiben. Die PRT6-abhängige Ubiquitinylierung konnte in vitro und in vivo gezeigt werden. Allerdings würde ein in vitro Ubiquitinylierungsversuch mit PRT6 diese Ergebnisse untermauern, da bisher nicht gezeigt werden konnte, dass es sich hierbei um eine E3-Ubiquitin-Ligase handelt. Des Weiteren sollten die Interaktionsexperimente mit rekombinanten Domänen von PRT6 weitergeführt werden. Hierzu sollte die UBR-Domäne mit anderen Domänen zusammen exprimiert werden, um zu untersuchen, ob ein größeres Protein evtl. die Bindung von RD21a stabilisiert. Auch ist zu überlegen, einen SPOT-Assay mit den N-terminalen Peptiden und der UBR-Box durchzuführen. Dieser sollte ein gutes Ergebnis hinsichtlich der Spezifität von PRT6 zum N-Terminus von RD21a liefern. Zur besseren Beschreibung von RD21a wäre eine Kristallisation des Proteins angeraten. So könnte man anschließend fundierte Aussagen über die Flexibilität und Angreifbarkeit des N-Terminus treffen und zudem eventuell physiologische Substrate der Protease in Arabidopsis

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durch docking-Experimente identifizieren. Dies würde wiederum die Suche nach einem sichtbaren Phänotypen und nach der biologischen Relevanz sehr erleichtern.

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