Die Mechanismen, die im Gehirn von Clcn3−/−-Mäusen und Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäusen zu der schwerwiegenden Neurodegeneration führen, sind immer noch ungeklärt. Die Ergebnisse der
58
vorliegenden Arbeit sprechen dafür, dass die Neurodegeneration im Hippocampus nicht auf einer gestörten Neurotransmission an GABAergen und glutamatergen Synapsen beruht und dass der Verlust von ClC-3sowie der vom H+-Transport entkopplte Cl−-Transport der ClC-3unc-Mutante, die Neurotransmitteraufnahme von GABA und Glutamat in synaptische Vesikel nicht beeinflusst. ClC-3 und -4 kommen im Gehirn nicht nur auf synaptischen Vesikeln, sondern auch auf Endosomen vor.
Möglicherweise geht die Neurodegeneration in Abwesenheit von ClC-3 auf eine verminderte Funktion von Endosomen zurück. Eine reduzierte Cl--Akkumulation in Endosomen oder ihre verminderte Ansäuerung könnten zu Neurodegeneration führen. Ähnliches wurde im Gehirn von Clcn7−/− - und Clcn7unc/unc -Mäusen beobachtet 17,115,116. In den beiden Clcn7-Mausmutanten kommt es, wie auch in Clcn3−/−-Mäusen, zu retinaler Degeneration. Bei ihnen prägt sich die Neurodegeneration ebenfalls besonders stark im Hippocampus, allerdings vor allem in der CA3-Region, aus. Es ist unklar, warum die Neurodegeneration in den Knockout- bzw. unc-Mausmodellen von ClC-3 und ClC-7, trotz ihrer breiten Expression in verschiedenen Gehirnregionen, gerade im Hippocampus so prominent ist. Möglicherweise ist der Hippocampus besonders sensitiv für die Fehlfunktion dieser Proteine. Konditionelle Knockout-Mäuse, denen ClC-7 spezifisch in Neuronen fehlt, überleben länger als Clcn7−/− -Mäuse. So konnte das Fortschreiten der Neurodegeneration in diesen länger verfolgt werden. Es wurde beobachtet, dass neben dem Hippocampus auch andere Gehirnregionen von Neurodegeneration betroffen waren 117. Clcn7−/−- und Clcn7unc/unc-Mäuse zeigen charakteristische Merkmale lysosomaler Speicherkrankheiten im Gehirn. Auch eine der drei, von den verschiedenen Arbeitsgruppen generierten, Clcn3−/−-Mäuse zeigte eine neuronale Akkumulation der ATP-Synthase-Untereinheit c, die für die neuronale Ceroid-Lipofuszinose typisch ist 63. In den Clcn3−/−-Mäusen, die im Labor von F. S. Lamb sowie in unserer Arbeitsgruppe generiert wurden konnten jedoch keine charakteristischen Merkmale lysosomaler Speicherkrankheiten detektiert werden 48,62. Es bleibt zu untersuchen, ob die Neurodegeneration in Abwesenheit von ClC-3 möglicherweise auf eine verminderte Funktion von Endosomen, beispielsweise in Form einer Akkumulation von Speichermaterial in Neuronen, zurückzuführen ist.
Die Ansäuerung synaptischer Vesikel durch die vakuoläre H+-ATPase ist Cl--abhängig. Transporter mit Cl--Leitfähigkeiten auf synaptischen Vesikeln sind wichtig für die Bereitstellung eines
59
Ausgleichsstroms, der die weitere Ansäuerung durch die vakuoläre H+-ATPase ermöglicht. Es ist nach wie vor umstritten, welche Rolle dem vermutlichen Cl-/H+-Austauscher ClC-3 für die Ansäuerung synaptischer Vesikel und endosomaler Kompartimente zukommt. Weitere Ansäuerungsexperimente an neurotransmitterspezifischen Subpopulationen von synaptischen Vesikeln, die z.B. positiv für VGLUT1 oder VGAT sind, und an Endosomenfraktionen aus Gehirngewebe der verschieden ClC-3 und ClC-4-Mausmodelle könnten weitere Aufschlüsse darüber geben.
Untersuchungen an Clcn3unc/unc-Mäuse sowie an Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäusen, die in dieser Arbeit verwendet wurden, ergaben eine neue Funktion für ClC-3, die in der Stabilisierung von ClC-4 liegt.
ClC-4 kann für den Funktionverlust von ClC-3 in Clcn3unc/unc-Mäusen kompensieren. Daneben kann Clcn3unc im Clcn3unc/unc/Clcn4−/− den Phänotyp der Clcn3−/−/Clcn4−/−-Mäuse retten. Denn der doppelte Clcn3−/−/Clcn4−/− ist letal. Ob die Kompensation im Clcn3unc/unc tatsächlich auf der Bildung von Heterodimeren von ClC-4 mit dem ClC-3unc-Protein beruht oder ob beispielsweise ClC-4-Homomere für die Kompensation von ClC-3 verantwortlich sind, die mithilfe von ClC-3unc -Homomeren zum Vesikel gelangen, ist nicht sicher geklärt und sollte weiter untersucht werden.
Sowohl die Funktionen von ClC-3 und ClC-4 im Gehirn als auch die Art und Weise wie diese miteinander zusammenhängen ist noch nicht verstanden. Es wäre auch interessant Mausmodelle zu untersuchen, in denen ClC-3 und -4 oder ClC-3unc nur teilweise vorhanden sind. Auf diese Weise könnten unterschiedliche Abstufungen der Ausprägung der bereits untersuchten Phänotypen betrachtet werden. Dies könnte relativ einfach durch Verpaarung der verschiedenen Mausmodelle erreicht werden. Es wäre beispielsweise interessant die Ausprägung und das Außmaß der Neurodegeneration in Clcn3−/−/Clcn4+/−Mäusen und Clcn3+/−/Clcn4−/−-Mäusen zu untersuchen.
Außerdem könnten Clcn3unc/unc/Clcn4+/−-Mäusen analysiert werden, die quantitativ wahrscheinlich die Hälfte an ClC-4 verglichen mit Clcn3unc/unc/Clcn4+/+-Mäusen exprimieren. Die Expression von ClC-4 würde in Clcn3unc/unc/Clcn4+/−-Mäusen quantitativ vermutlich immer noch höher ausfallen als in Clcn3−/−-Mäusen. In Clcn3unc/unc/Clcn4+/−-Mäusen, würde die verbleibende Menge an ClC-4 mit Hilfe des Clcn3unc-Proteins vermutlich immer noch stabilisiert werden können und die endosomalen Kompartimente bzw. synaptischen Vesikel erreichen können. Dies würde weiteren Aufschluss
60
darüber geben, welche Bedeutung die quantitative Reduktion von ClC-4 an sich, im Gegensatz zu einer fehlenden Stabilisierung und falschen Lokalisation von ClC-4 wie vermutlich im Fall der Clcn3−/−-Mäusen, hat. Umgekehrt könnte auch untersucht werden wie sich die partielle Entkopplung von ClC-3 im Gehirn in Clcn3+/unc/ Clcn4−/−-Mäusen ausprägt. Um die Bedeutung der Kopplung des Cl--Transports an den H+-Transport von ClC-4 und ClC-3 besser zu verstehen, könnten, analog zu Clcn3unc/unc -Mäusen, Clcn4unc/unc-Mäuse generiert werden. Vermutlich würden diese einen ähnlich unauffälligen Phänotyp wie Clcn4−/−-Mäuse zeigen. Die Clcn4unc/unc-Mäuse könnten darüber hinaus mit Clcn3unc/unc-Mäusen verpaart werden um Clcn3unc/unc/Clcn4unc/unc-Mäuse zu erhalten.
Clcn3unc/unc/Clcn4unc/unc-Mäuse würden ein elegantes Mausmodell darstellen um die biologische Relevanz der Kopplung des Cl--Transports an den H+-Transport in ClC-3 und ClC-4 genauer zu untersuchen. Genauso wie in Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäusen könnte ClC-4 die Funktion des Cl−/H+ -Austauschs von ClC-3 nicht mehr kompensieren. Doch anders als in Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäusen, würde ClC-4 nicht fehlen, sondern vermutlich genauso wie für ClC-3 angenommen, anstelle der Funktion als Cl−/H+-Austauscher über eine konstituive Cl--Leitfähigkeit verfügen. Es wäre interessant zu untersuchen, ob die Ausprägung im Phänotyp der Clcn3unc/unc/Clcn4unc/unc-Mäuse dem der Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäuse ähnlich wäre oder ob die konstituive Cl--Leitfähigkeit von ClC-4unc möglicherweise zu einem milderen oder anderen Phänotyp verglichen mit Clcn3unc/unc/Clcn4−/− -Mäusen führen würde. Die Clcn3unc/unc/Clcn4unc/unc-Mäuse könnten, ähnlich wie in dieser Arbeit, elektrophyiologisch untersucht werden. Darüber hinaus könnten Ansäuerungsversuche an immunisolierten Transmittertransporter-spezifischen, synaptischen Vesikelpopulationen sowie an endosomalen Fraktionen von Clcn3unc/unc/Clcn4unc/unc-Mäusen durchgeführt werden um die Bedeutung von ClC-3 und ClC-4 im Gehirn an den jeweiligen intrazellulären Kompartimenten besser zu verstehen.
61 5 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik die Bedeutung von ClC-3 für die inhibitorische und exzitatorische synaptische Transmission anhand von Knockout- und Knockin-Mausmodellen von ClC-3 und -4 untersucht. Im Gehirn kommt ClC-3 eine bedeutende Rolle zu, was im Hinblick auf die ausgeprägte Neurodegeneration mit komplettem Verlust des Hippocampus in Clcn3−/−-Mäusen deutlich wird. ClC-3, höchstwahrscheinlich ein Cl-/H+-Austauscher, der auf synaptischen Vesikeln und endosomalen Kompartimenten vorkommt, ist möglicherweise durch Bereitstellung eines Cl--Ausgleichstroms für die vakuoläre H+-ATPase, bei der Ansäuerung und bei der Cl--Akkumulation dieser intrazellulären Kompartimente beteiligt. An synaptischen Vesikeln kann der pH-Gradient zur Neurotransmitteraufnahme genutzt werden. Die Bedeutung von ClC-3 für die GABA-Aufnahme in synaptische Vesikel von Neuronen und sein Einfluss auf die Quantengröße von inhibitorischen Synapsen sind umstritten. Um dies zu untersuchen, wurden mIPSCs in CA1-Pyramidenzellen in Clcn3−/−-Mäusen abgeleitet. Um außerdem die physiologische Relevanz der Cl−/H+-Austauscher-Funktion von ClC-3 für die GABAerge synaptische Transmission zu untersuchen, sollten mIPSCs in einer ClC-3unc-Mutante untersucht werden, in welcher ClC-3 vermutlich anstelle seiner Cl−/H+-Austauscher-Funktion eine reine Cl−-Leitfähigkeit aufweist. Dafür wurden Clcn3unc/unc-Mäuse verwendet. In Clcn3unc/unc-Mäusen kann ClC-4 möglicherweise für die Abwesenheit der Cl−/H+-Austauscher-Funktion von ClC-3 kompensieren. Aus diesem Grund wurden Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäuse generiert, die nun tatsächlich eine ClC-3unc – Mausmutante darstellen, da ClC-4 fehlt und die Cl−/H+-Austauscherfunktion von ClC-3 nicht mehr ausgleichen kann. mIPSCs wurden in Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäusen, sowie in den einfachen Clcn3unc/unc- und Clcn4−/−-Mausmodellen, abgeleitet. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Amplitude der mIPSCs, die ein Maß für die vesikuläre GABA-Konzentration darstellt, in keinem der untersuchten Mausmodelle verändert war. Auch die Frequenz der mIPSCs, ein Maß für die Anzahl der Synapsen und für die Wahrscheinlichkeit der spontanen Vesikelentleerung, war unverändert. Einzig in Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäusen war die Frequenz der mIPSCs leicht vermindert, was wahrscheinlich auf bereits einsetzende neurodegenerative Prozesse zurückzuführen war. Auch die glutamatergen exzitatorischen Miniaturströme, die an CA1-Pyramidenzellen von Clcn3unc/unc/Clcn4−/−-Mäusen abgeleitet wurden, waren in ihrer Amplitude im Vergleich zu Clcn3+/+/Clcn4−/−-Mäusen
62
unverändert. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen dafür, dass ClC-3 für die Aufnahme von GABA und Glutamat in synaptische Vesikel keine bedeutende Rolle spielt. Für die stabile Expression von ClC-4 im Gehirn spielt das Vorhandensein von ClC-3 eine wichtige Rolle, die aber nicht auf dessen Funktion als Cl−/H+-Austauscher beruht, da die Expression von ClC-4 in Clcn3−/−-Mäusen, nicht aber in Clcn3unc/unc- Mäusen, deutlich vermindert war. Es ist immer noch unklar, welche wichtige Funktion ClC-3 im Gehirn zukommt, die für die ausgeprägte Neurodegeneration in Abwesenheit von ClC-3 ursächlich ist. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass in Abwesenheit von ClC-3 sowie bei dessen Funktionsverust als Cl−/H+-Austauscher die Quantengröße von GABAergen und glutamatergen Synapsen unbeeinflusst bleibt.
63 6 Literaturverzeichnis
1. Hille, B. Chapter 1, Introduction 1. In: Ion channels of excitable membranes. 3rd ed.
Sunderland Massachusetts, U.S.A.: Sinauer, 1–22 (2001).
2. Hille, B. Chapter 5, Potassiom channels and chloride channels. In: Ion channels of excitable membranes. 3rd ed. Sunderland Massachusetts. U.S.A.: Sinauer, 131-167 (2001).
3. Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F. & Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol. Rev. 82, 503–568 (2002).
4. Riordan, J. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 245, 1066 –1073 (1989).
5. Jentsch, T. J., Steinmeyer, K. & Schwarz, G. Primary structure of Torpedo marmorata chloride channel isolated by expression cloning in Xenopus oocytes. Nature 348, 510–514 (1990).
6. Jentsch, T. J. CLC chloride channels and transporters: from genes to protein structure, pathology and physiology. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 43, 3–36 (2008).
7. Steinmeyer, K. et al. Inactivation of muscle chloride channel by transposon insertion in myotonic mice. Nature 354, 304–308 (1991).
8. Koch, M. C. et al. The skeletal muscle chloride channel in dominant and recessive human myotonia. Science 257, 797–800 (1992).
9. Staley, K., Smith, R., Schaack, J., Wilcox, C. & Jentsch, T. J. Alteration of GABAA receptor function following gene transfer of the CLC-2 chloride channel. Neuron 17, 543–551 (1996).
10. Rinke, I., Artmann, J. & Stein, V. ClC-2 voltage-gated channels constitute part of the background conductance and assist chloride extrusion. J. Neurosci. 30, 4776–4786 (2010).
11. Bösl, M. R. et al. Male germ cells and photoreceptors, both dependent on close cell-cell interactions, degenerate upon ClC-2 Cl(-) channel disruption. EMBO J. 20, 1289–1299 (2001).
12. Peña-Münzenmayer, G. et al. Basolateral localization of native ClC-2 chloride channels in absorptive intestinal epithelial cells and basolateral sorting encoded by a CBS-2 domain di-leucine motif. J. Cell. Sci. 118, 4243–4252 (2005).
13. Jeworutzki, E. et al. GlialCAM, a Protein Defective in a Leukodystrophy, Serves as a ClC-2 Cl− Channel Auxiliary Subunit. Neuron 73, 951–961 (2012).
14. Simon, D. B. et al. Mutations in the chloride channel gene, CLCNKB, cause Bartter’s syndrome type III. Nat. Genet. 17, 171–178 (1997).
15. Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J. Physiol. (Lond.) 578, 633–640 (2007).
16. Novarino, G., Weinert, S., Rickheit, G. & Jentsch, T. J. Endosomal chloride-proton exchange rather than chloride conductance is crucial for renal endocytosis. Science 328, 1398–1401 (2010).
17. Weinert, S. et al. Lysosomal pathology and osteopetrosis upon loss of H+-driven lysosomal Cl- accumulation. Science 328, 1401–1403 (2010).
18. Günther, W., Piwon, N. & Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445, 456–462 (2003).
19. Lloyd, S. E. et al. A common molecular basis for three inherited kidney stone diseases. Nature 379, 445–449 (1996).
64
20. Poët, M. et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13854–13859 (2006).
21. Kornak, U. et al. Loss of the ClC-7 chloride channel leads to osteopetrosis in mice and man.
Cell 104, 205–215 (2001).
22. Middleton, R. E., Pheasant, D. J. & Miller, C. Purification, reconstitution, and subunit composition of a voltage-gated chloride channel from Torpedo electroplax. Biochemistry 33, 13189–13198 (1994).
23. Steinmeyer, K., Lorenz, C., Pusch, M., Koch, M. C. & Jentsch, T. J. Multimeric structure of ClC-1 chloride channel revealed by mutations in dominant myotonia congenita (Thomsen).
EMBO J. 13, 737–743 (1994).
24. Ludewig, U., Pusch, M. & Jentsch, T. J. Two physically distinct pores in the dimeric ClC-0 chloride channel. Nature 383, 340–343 (1996).
25. Lorenz, C., Pusch, M. & Jentsch, T. J. Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362–13366 (1996).
26. Miller, C. Open-State Substructure of Single Chloride Channels from Torpedo Electroplax.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences 299, 401 – 411 (1982).
27. Dutzler, R., Campbell, E. B., Cadene, M., Chait, B. T. & MacKinnon, R. X-ray structure of a ClC chloride channel at 3.0 A reveals the molecular basis of anion selectivity. Nature 415, 287–294 (2002).
28. Feng, L., Campbell, E. B., Hsiung, Y. & MacKinnon, R. Structure of a Eukaryotic CLC Transporter Defines an Intermediate State in the Transport Cycle. Science 330, 635 –641 (2010).
29. Chen, M.-F. & Chen, T.-Y. Side-chain Charge Effects and Conductance Determinants in the Pore of ClC-0 Chloride Channels. J Gen Physiol 122, 133–145 (2003).
30. Miller, C. ClC chloride channels viewed through a transporter lens. Nature 440, 484–489 (2006).
31. Pusch, M., Ludewig, U., Rehfeldt, A. & Jentsch, T. J. Gating of the voltage-dependent chloride channel CIC-0 by the permeant anion. Nature 373, 527–531 (1995).
32. Lisal, J. & Maduke, M. The ClC-0 chloride channel is a ‘broken’ Cl-/H+ antiporter. Nat Struct Mol Biol 15, 805–810 (2008).
33. Picollo, A. & Pusch, M. Chloride/proton antiporter activity of mammalian CLC proteins ClC-4 and ClC-5. Nature 436, 420–423 (2005).
34. Neagoe, I., Stauber, T., Fidzinski, P., Bergsdorf, E.-Y. & Jentsch, T. J. The late endosomal ClC-6 mediates proton/chloride countertransport in heterologous plasma membrane expression.
J. Biol. Chem 285, 21689–21697 (2010).
35. Leisle, L., Ludwig, C. F., Wagner, F. A., Jentsch, T. J. & Stauber, T. ClC-7 is a slowly voltage-gated 2Cl(-)/1H(+)-exchanger and requires Ostm1 for transport activity. EMBO J. 30, 2140–
2152 (2011).
36. Chen, T. Y. Extracellular zinc ion inhibits ClC-0 chloride channels by facilitating slow gating.
J. Gen. Physiol. 112, 715–726 (1998).
37. Fong, P., Rehfeldt, A. & Jentsch, T. J. Determinants of slow gating in ClC-0, the voltage-gated chloride channel of Torpedo marmorata. Am. J. Physiol. 274, C966–973 (1998).
65
38. Estévez, R., Pusch, M., Ferrer-Costa, C., Orozco, M. & Jentsch, T. J. Functional and structural conservation of CBS domains from CLC chloride channels. J. Physiol. (Lond.) 557, 363–378 (2004).
39. Bykova, E. A., Zhang, X.-D., Chen, T.-Y. & Zheng, J. Large movement in the C terminus of CLC-0 chloride channel during slow gating. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 1115–1119 (2006).
40. Alex, B. The structure of a domain common to archaebacteria and the homocystinuria disease protein. Trends in Biochemical Sciences 22, 12–13 (1997).
41. Meyer, S. & Dutzler, R. Crystal Structure of the Cytoplasmic Domain of the Chloride Channel ClC-0. Structure 14, 299–307 (2006).
42. Scheel, O., Zdebik, A. A., Lourdel, S. & Jentsch, T. J. Voltage-dependent electrogenic chloride/proton exchange by endosomal CLC proteins. Nature 436, 424–427 (2005).
43. Graves, A. R., Curran, P. K., Smith, C. L. & Mindell, J. A. The Cl-/H+ antiporter ClC-7 is the primary chloride permeation pathway in lysosomes. Nature 453, 788–792 (2008).
44. Accardi, A. & Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of ClC Cl- channels. Nature 427, 803–807 (2004).
45. Zifarelli, G. & Pusch, M. Conversion of the 2 Cl-/1 H+ antiporter ClC-5 in a NO3-/H+
antiporter by a single point mutation. EMBO J 28, 175–182 (2009).
46. Kawasaki, M. et al. Cloning and expression of a protein kinase C-regulated chloride channel abundantly expressed in rat brain neuronal cells. Neuron 12, 597–604 (1994).
47. Borsani, G., Rugarli, E. I., Taglialatela, M., Wong, C. & Ballabio, A. Characterization of a human and murine gene (CLCN3) sharing similarities to voltage-gated chloride channels and to a yeast integral membrane protein. Genomics 27, 131–141 (1995).
48. Stobrawa, S. M. et al. Disruption of ClC-3, a chloride channel expressed on synaptic vesicles, leads to a loss of the hippocampus. Neuron 29, 185–196 (2001).
49. Maritzen, T., Keating, D. J., Neagoe, I., Zdebik, A. A. & Jentsch, T. J. Role of the vesicular chloride transporter ClC-3 in neuroendocrine tissue. J. Neurosci. 28, 10587–10598 (2008).
50. Salazar, G. et al. AP-3-dependent mechanisms control the targeting of a chloride channel (ClC-3) in neuronal and non-neuronal cells. J. Biol. Chem. 279, 25430–25439 (2004).
51. Hara-Chikuma, M. et al. ClC-3 chloride channels facilitate endosomal acidification and chloride accumulation. J. Biol. Chem. 280, 1241–1247 (2005).
52. Barg, S. et al. Priming of insulin granules for exocytosis by granular Cl(-) uptake and acidification. J. Cell. Sci. 114, 2145–2154 (2001).
53. Deriy, L. V. et al. The granular chloride channel ClC-3 is permissive for insulin secretion. Cell Metab. 10, 316–323 (2009).
54. Li, D.-Q. et al. Suppression of sulfonylurea- and glucose-induced insulin secretion in vitro and in vivo in mice lacking the chloride transport protein ClC-3. Cell Metab. 10, 309–315 (2009).
55. Suzuki, T. et al. Intracellular localization of ClC chloride channels and their ability to form hetero-oligomers. J. Cell. Physiol. 206, 792–798 (2006).
56. Zhao, Z., Li, X., Hao, J., Winston, J. H. & Weinman, S. A. The ClC-3 chloride transport protein traffics through the plasma membrane via interaction of an N-terminal dileucine cluster with clathrin. J. Biol. Chem. 282, 29022–29031 (2007).
57. Kawasaki, M., Suzuki, M., Uchida, S., Sasaki, S. & Marumo, F. Stable and functional expression of the CIC-3 chloride channel in somatic cell lines. Neuron 14, 1285–1291 (1995).
66
58. Huang, P. et al. Regulation of human CLC-3 channels by multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 276, 20093–20100 (2001).
59. Isnard-Bagnis, C. et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium:
immunofluorescence and RT-PCR after LCM. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 284, C220–232 (2003).
60. Wang, X. Q. et al. CLC-3 channels modulate excitatory synaptic transmission in hippocampal neurons. Neuron 52, 321–333 (2006).
61. Mitchell, J. et al. An expanded biological repertoire for Ins(3,4,5,6)P4 through its modulation of ClC-3 function. Curr. Biol. 18, 1600–1605 (2008).
62. Dickerson, L. W. et al. Altered GABAergic function accompanies hippocampal degeneration in mice lacking ClC-3 voltage-gated chloride channels. Brain Res. 958, 227–250 (2002).
63. Yoshikawa, M. et al. CLC-3 deficiency leads to phenotypes similar to human neuronal ceroid lipofuscinosis. Genes Cells 7, 597–605 (2002).
64. Duan, D., Winter, C., Cowley, S., Hume, J. R. & Horowitz, B. Molecular identification of a volume-regulated chloride channel. Nature 390, 417–421 (1997).
65. Yamazaki, J. et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. J. Physiol. (Lond.) 507 ( Pt 3), 729–736 (1998).
66. Von Weikersthal, S. F., Barrand, M. A. & Hladky, S. B. Functional and molecular characterization of a volume-sensitive chloride current in rat brain endothelial cells. J. Physiol.
(Lond.) 516 ( Pt 1), 75–84 (1999).
67. Arreola, J. et al. Secretion and cell volume regulation by salivary acinar cells from mice lacking expression of the Clcn3 Cl− channel gene. The Journal of Physiology 545, 207 –216 (2002).
68. Matsuda, J. J. et al. Overexpression of CLC-3 in HEK293T cells yields novel currents that are pH dependent. American Journal of Physiology - Cell Physiology 294, C251 –C262 (2008).
69. Li, X., Shimada, K., Showalter, L. A. & Weinman, S. A. Biophysical properties of ClC-3 differentiate it from swelling-activated chloride channels in Chinese hamster ovary-K1 cells. J.
Biol. Chem. 275, 35994–35998 (2000).
70. Li, X., Wang, T., Zhao, Z. & Weinman, S. A. The ClC-3 chloride channel promotes acidification of lysosomes in CHO-K1 and Huh-7 cells. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 282, C1483–1491 (2002).
71. Scheel, O., Zdebik, A. A., Lourdel, S. & Jentsch, T. J. Voltage-dependent electrogenic chloride/proton exchange by endosomal CLC proteins. Nature 436, 424–427 (2005).
72. Matsuda, J. J., Filali, M. S., Collins, M. M., Volk, K. A. & Lamb, F. S. The ClC-3 Cl-/H+
antiporter becomes uncoupled at low extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 2569–2579 (2010).
73. Johnson, R. G., Jr. Accumulation of biological amines into chromaffin granules: a model for hormone and neurotransmitter transport. Physiol. Rev. 68, 232–307 (1988).
74. Parsons, S. M., Prior, C. & Marshall, I. G. Acetylcholine transport, storage, and release. Int.
Rev. Neurobiol. 35, 279–390 (1993).
75. Maycox, P. R., Deckwerth, T., Hell, J. W. & Jahn, R. Glutamate uptake by brain synaptic vesicles. Energy dependence of transport and functional reconstitution in proteoliposomes. J.
Biol. Chem. 263, 15423–15428 (1988).
67
76. Bellocchio, E. E., Reimer, R. J., Fremeau, R. T., Jr & Edwards, R. H. Uptake of glutamate into synaptic vesicles by an inorganic phosphate transporter. Science 289, 957–960 (2000).
77. Kish, P. E., Fischer-Bovenkerk, C. & Ueda, T. Active transport of gamma-aminobutyric acid and glycine into synaptic vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3877–3881 (1989).
78. Hell, J. W., Maycox, P. R. & Jahn, R. Energy dependence and functional reconstitution of the gamma-aminobutyric acid carrier from synaptic vesicles. J. Biol. Chem. 265, 2111–2117 (1990).
79. Riazanski, V. et al. Presynaptic CLC-3 determines quantal size of inhibitory transmission in the hippocampus. Nat. Neurosci. 14, 487–494 (2011).
80. Matsuda, J. J., Filali, M. S., Moreland, J. G., Miller, F. J. & Lamb, F. S. Activation of swelling-activated chloride current by tumor necrosis factor-alpha requires ClC-3-dependent endosomal reactive oxygen production. J. Biol. Chem. 285, 22864–22873 (2010).
81. Cuddapah, V. A. & Sontheimer, H. Molecular interaction and functional regulation of ClC-3 by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in human malignant glioma. J.
Biol. Chem. 285, 11188–11196 (2010).
82. Slegtenhorst, M. A. va. et al. A gene from the Xp22.3 region shares homology with voltage-gated chloride channels. Human Molecular Genetics 3, 547 –552 (1994).
83. Mohammad-Panah, R. et al. The chloride channel ClC-4 co-localizes with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and may mediate chloride flux across the apical membrane of intestinal epithelia. J. Biol. Chem. 277, 566–574 (2002).
84. Mohammad-Panah, R. et al. The chloride channel ClC-4 contributes to endosomal acidification and trafficking. J. Biol. Chem. 278, 29267–29277 (2003).
85. Friedrich, T., Breiderhoff, T. & Jentsch, T. J. Mutational analysis demonstrates that ClC-4 and ClC-5 directly mediate plasma membrane currents. J. Biol. Chem. 274, 896–902 (1999).
86. Adler, D. A. et al. Evidence of evolutionary up-regulation of the single active X chromosome in mammals based on Clc4 expression levels in Mus spretus and Mus musculus. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 94, 9244–9248 (1997).
87. Rickheit, G. et al. Role of ClC-5 in renal endocytosis is unique among ClC exchangers and does not require PY-motif-dependent ubiquitylation. J. Biol. Chem. 285, 17595–17603 (2010).
88. Okkenhaug, H. et al. The human ClC-4 protein, a member of the CLC chloride channel/transporter family, is localized to the endoplasmic reticulum by its N-terminus. FASEB J. 20, 2390–2392 (2006).
89. Ohtaki, H. et al. Accumulation of autofluorescent storage material in brain is accelerated by ischemia in chloride channel 3 gene-deficient mice. Journal of Neuroscience Research n/a–n/a (2012). doi:10.1002/jnr.23110
90. Südhof, T. C. The synaptic vesicle Cycle. Annual Review of Neuroscience 27, 509–547 (2004).
91. Gundelfinger, E. D., Kessels, M. M. & Qualmann, B. Temporal and spatial coordination of exocytosis and endocytosis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 127–139 (2003).
92. Toledo, G. A. de, Fernández-Chacón, R. & Fernández, J. M. Release of secretory products during transient vesicle fusion. Nature 363, 554–558 (1993).
93. Katz, B. Quantal mechanism of neural transmitter release. Science 173, 123–126 (1971).
94. Frerking, M., Borges, S. & Wilson, M. Variation in GABA mini amplitude is the consequence of variation in transmitter concentration. Neuron 15, 885–895 (1995).