Im Verlauf der Studie kam es zu verschiedenen Komplikationen bei der Vorbehandlung des Gewebes und w¨ahrend des Scanvorgangs. Diese f ¨uhrten zum Teil zu sichtbaren Ar-tefakten in den mikroskopischen Bildern. Im Folgenden werden die einzelnen Artefakte erl¨autert.
Silikon im Pr¨aparat
Wird beim Aufkleben des Deckglases auf den Objekttr¨ager eine zu große Menge Silikon verwendet, kommt dieses mit dem Gewebe in Kontakt.
Abbildung 25a zeigt den Rand eines Pr¨aparats das vollst¨andig mit Silikon benetzt ist.
Das Silikon stellt sich in Form von sehr kleinen, weißen Punkten dar, die an einen Sternen-himmel erinnern. Sie machen es unm ¨oglich die verschiedenen anatomischen Strukturen der Haut zu erkennen.
Vereinzelte Silikonareale (Pfeile) innerhalb eines Pr¨aparates erscheinen als scharf abge-grenzte, helle, tropfenf ¨ormige Bereiche mit dunklen Anteilen, die von einem schwarzen Saum umgeben sind (Abb. 25b).
(a) Silikontropfen am Rand (b) Silikontropfen in der Mitte
Abbildung 25: Pr¨aparate der gesunden Haut mit einem Silikontropfen im RM. F¨arbung:
Acridine Orange [Hartmann et al., 2015b]
Ein weiteres Problem bei der Aufbringung einer zu großen Menge Silikon ist, dass ein vollst¨andiges Zusammendr ¨ucken der beiden Objekttr¨ager nicht mehr m ¨oglich ist. Dies f ¨uhrt dazu, dass das Pr¨aparat nicht gleichm¨aßig flach auf dem unteren Objekttr¨ager
auf-liegt und somit ein unscharfes Bild entsteht (Abb. 26).
Abbildung 26: Unscharfes Pr¨aparat der gesunden Haut, das mit einer zu großen Menge Silikon fixiert wurde im RM. F¨arbung: Acridine Orange
Fasern der Kompresse im Pr¨aparat
Beim Schneiden des Pr¨aparats mit dem Skalpell auf einer Kompresse als Unterlage k ¨onnen die Fasern der Kompresse angeschnitten werden und am Gewebe haften. Werden die-se anschließend nicht entfernt und zusammen mit dem Pr¨aparat gescannt, sind sie im mikroskopischen Bild sichtbar (Pfeile). Sie erscheinen als weiße dicht beisammen liegen-de St¨abchen, die scharf begrenzt sind. Sie erschweren die Beurteilung liegen-des Pr¨aparats und k ¨onnen in einigen F¨allen sogar zu einer fehlerhaften Diagnose f ¨uhren. Im FM lassen sich die Fasern noch besser erkennen als im RM (Abb. 27).
(a) Reflexions-Modus (b) Fluoreszenz-Modus
Abbildung 27: Fasern einer Kompresse in einem Pr¨aparat der gesunden Haut. F¨arbung Acridine Orange [Hartmann et al., 2015b]
Scannen der falschen Pr¨aparat-Seite
W¨ahrend des gesamten Vorgangs ist es wichtig stets die Orientierung des Objekttr¨agers beizubehalten. Wird das Pr¨aparat um 180◦ gedreht und zeigt mit der falschen Seite nach unten zum Laserstrahl, kann der Betrachter dies schnell im mikroskopischen Bild
erken-5 Ergebnisse
nen, da im RM eine scharfe Darstellung der Strukturen nicht m ¨oglich ist. Das Bild wirkt stark verwaschen und es ist unm ¨oglich einzelne Strukturen zu identifizieren (Abb. 28). Im FM ist keine Darstellung m ¨oglich, sodass das Bild vollst¨andig schwarz angezeigt wird.
Abbildung 28: Ungef¨arbte Seite eines Pr¨aparats der gesunden Haut im RM. F¨arbung: Acri-dine Orange [Hartmann et al., 2015b]
Scannen ohne Ultraschallgel
Das Auftragen des Ultraschallgels auf die Unterseite des Objekttr¨agers stellt eine Not-wendigkeit f ¨ur die Optimierung der numerischen Apertur dar. Wird dieser Schritt nicht durchgef ¨uhrt, ist die Folge ein unscharfes, tr ¨ubes Bild im RM. Das gesamte Bild wirkt ver-schwommen und besitzt eine sandkornartige Struktur (Abb. 29a). Im FM erscheint das Bild vollkommen schwarz mit Ausnahme einiger dunkelgrauer, undefinierbarer Struktu-ren (Abb. 29b).
(a) Reflexions-Modus (b) Fluoreszenz-Modus
Abbildung 29: Ohne Ultraschallgel gescanntes Pr¨aparat der gesunden Haut. F¨arbung:
Acridine Orange
Dicke des Pr¨aparats
Beim Schneiden des Gewebes sollte darauf geachtet werden eine m ¨oglichst schmale Pr¨apa-ratscheibe zu gewinnen. Ein sehr dick geschnittenes Pr¨aparat l¨asst sich im Mikroskop nicht scharf darstellen. Das gesamte Bild wirkt verwaschen (Abb. 30). Ab einer bestimm-ten St¨arke ist es nicht mehr m ¨oglich das Pr¨aparat in die Haltevorrichtung des Mikroskops einzuspannen. Der Hersteller des Mikroskops empfiehlt eine maximale Dicke von 5mm.
(a) Reflexions-Modus (b) Fluoreszenz-Modus
Abbildung 30: Zu dickes Pr¨aparat der gesunden Haut. F¨arbung: Acridine Orange Pr¨aparat in Formalin
Wird das Pr¨aparat vor dem F¨arbe- und Scanvorgang in Formalin eingelegt, ist die Qua-lit¨at des Bilds im FM sehr stark vermindert. Außerdem ist die Intensit¨at der Fluoreszenz deutlich geringer (Abb. 31b). Das Bild im RM wird durch Formalin nicht beeinflusst (Abb.
31a).
(a) Reflexions-Modus (b) Fluoreszenz-Modus
Abbildung 31: Pr¨aparat der gesunden Haut in Formalin. F¨arbung: Acridine Orange
5 Ergebnisse
Gefrorenes Pr¨aparat
Ist es nicht m ¨oglich die frisch exzidierten Pr¨aparate direkt am Operationstag zu unter-suchen, werden sie zun¨achst eingefroren und zum n¨achstm ¨oglichen Untersuchungszeit-punkt aufgetaut. Das weitere Vorgehen unterscheidet sich nicht vom standardisierten Ab-lauf. Die Qualit¨at der Bilder der aufgetauten Pr¨aparate ist im RM durch einen vermin-derten Kontrast und eine verminderte Bildsch¨arfe geringer als die der frischen Pr¨aparate (Abb. 32a). Im FM konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (Abb. 32b)
(a) Reflexions-Modus (b) Fluoreszenz-Modus
Abbildung 32: Pr¨aparat der gesunden Haut, das am Operationstag eingefroren und am Folgetag aufgetaut wurde. F¨arbung: Acridine Orange
Ausgetrocknetes Pr¨aparat
Das Austrocknen eines Pr¨aparats kann verschiedene Ursachen haben. Zum einen ist ein Verdampfen der Fl ¨ussigkeit m ¨oglich wenn das Pr¨aparat zu lange untersucht und gescannt wird. Zum anderen trocknet das Pr¨aparat aus, wenn es im Mikroskop belassen wird und der Untersucher den Laser nicht ausschaltet. Die Ursache liegt in beiden F¨allen in der hohen W¨armeentwicklung des Lasers. Die Konsequenz ist, dass sowohl der Fluoreszenz-farbstoff, als auch die Gewebefl ¨ussigkeit verdampfen. Das mikroskopische Bild verliert deutlich an Qualit¨at, da es unscharf wirkt und Spalten entstehen (Pfeile) deren Ursache in der Schrumpfung des Gewebes liegt (Abb. 33).
(a) Reflexions-Modus (b) Fluoreszenz-Modus
Abbildung 33: Ausgetrocknetes Pr¨aparat der gesunden Haut mit sichtbarer Spaltbildung.
F¨arbung: Acridine Orange H¨aufigkeit des Auftretens der Artefakte
Die folgende Tabelle 5 zeigt m ¨ogliche Artefakte, ihre Ursachen, sowie die Maßnahmen, durch welche sie verhindert werden k ¨onnen. Außerdem zeigt die Tabelle die prozentualen H¨aufigkeiten ihres Auftretens in unserer Studie.
Artefakt Ursache L ¨osung Anzahl
innerhalb von 50 Pr¨aparaten
Prozent innerhalb
von 50 Pr¨aparaten
Prozent an allen
Artefak-ten Dunkle, scharf
begrenzte Lakunen mit weiß
gesprenkeltem Zentrum
Silikon auf dem Gewebe
Vorsichtiges Umgehen mit der
Silikonflasche w¨ahrend der Fixierung
2/50 4% 9%
Zahlreiche weiße Punkte,
sternen-himmelartig am Pr¨aparatrand
Zu große Menge Silikon an den R¨andern des
Objekttr¨agers
Verwendung von sehr kleinen
Mengen Silikon zur Fixierung der beiden Objekttr¨ager
3/50 6% 13%
Weiße, ineinander verflochtene st¨abchenf ¨or-mige Strukturen
Fasern der Kompresse auf dem Pr¨aparat
Schneiden des Gewebes auf einer festen Unterlage anstelle der Kompresse
5/50 10% 23%
5 Ergebnisse
Verschwom-mene, kontrastarme Darstellung des Gewebes im RM, schwarze Aufnahme im FM
Scannen der ungef¨arbten Seite des Pr¨aparats
Markierung des Objekttr¨agers
1/50 2% 5%
Verschwom-mene, kontrastarme Darstellung des Gewebes
Zu wenig oder kein
Ultraschallgel
Verwendung von einer gr ¨oßeren Menge an Ultraschallgel bei langer Scanzeit zur Vermeidung der
Austrocknung des Gewebes
2/50 4% 9%
Unscharfe, ver-schwommene Aufnahmen
Pr¨aparatscheibe zu dick
geschnitten
Schneiden von d ¨unnen Gewe-bescheiben mit einer Dicke von maximal 0,5cm
6/50 12% 27%
Im FM kann das Gewebe nicht dargestellt werden und zeigt ein schwarzes Bild
Pr¨aparat wurde in Formalin eingelegt
Einlegen des Gewebes vor dem
Scanvorgang ausschließlich in NaCl
1/50 2% 5%
Verminderte Qualit¨at der Aufnahme, dunkle Spalten innerhalb des Pr¨aparats durch Gewebe-schrumpfung
Ausgetrock-netes Pr¨aparat
Minimierung der Vorberei-tungszeit des Pr¨aparats und Ausschalten des Lasers w¨ahrend Pausen
2/50 4% 9%
Tabelle 5: Ursachen und L ¨osungsm ¨oglichkeiten f ¨ur das Auftreten von Artefakten, sowie die H¨aufigkeit ihres Vorkommens in Zahlen und Prozent. ( ¨Uberarbeitet nach [Hartmann et al., 2015b])