Aufnahme und Akkumulation des Substrates Ammoniak durch N. europaea

N. europaea besitzt eine katalytisch aktive, cytoplasmatische AMO (Tab. 1 und 2; Abb. 7 und 8; Gilch et al., 2009a). Da die lösliche AMO ungefähr in gleicher Menge vorliegt wie die membrangebundene AMO (Tab. 2) und zudem beide Formen eine ähnliche spezifische Aktivität aufweisen (Tab. 1), kann angenommen werden, dass die lösliche Form der AMO maßgeblich an der Ammoniakoxidation und damit an der Energiegewinnung von N. europaea beteiligt ist. Gleichermaßen ist anzunehmen, dass auch die membrangebundene AMO ihr Substrat Ammoniak im Cytoplasma oxidiert, da der pH im Periplasma (pH < 6; Weidinger et al., 2007) zu gering ist, um Ammoniakoxidation durch die AMO zu ermöglichen (Suzuki et al., 1974; Schmidt et al., 1998). Der pH im Cytoplasma (pH 7-8; Kumar & Nicholas, 1983) entspricht dagegen dem pH-Optimum der Ammoniakoxidation durch die AMO (Suzuki et al., 1974; Schmidt et al., 1998). Da bei der Oxidation von Ammoniak zu Nitrit effektiv nur zwei Reduktionsäquivalente pro NH₃-Molekül anfallen (bei der vollständigen Oxidation von Glukose fallen im Vergleich 12 Reduktionsäquivalente an), muss N. europaea eine große Anzahl von Ammoniakmolekülen zu Nitrit oxidieren, um genügend Energie für bioenergetische Zwecke zu gewinnen. Eine passive Diffusion des membrangängigen Ammoniaks in das Cytoplasma (Kleiner, 1981) reicht allerdings nicht aus, um die hohen Ammoniakoxidationsaktivitäten von N. europaea zu erklären (Keen & Prosser, 1987; Zart &

Bock, 1998; Chapman et al., 2006; Beyer et al., 2009; Güven & Schmidt, 2009). Dies gilt insbesondere für Nitrosomonas-Populationen an ihren natürlichen Habitaten, da dort die frei verfügbare Konzentration an NH3 (an den meisten Orten unter 1 µM bei pH 7; Stein et al., 2007; Bollmann et al., 2002) nicht ausreichen würde, um den Energiebedarf der Ammoniakoxidanten zu decken. Überdies wurden signifikante Ammoniak-oxidationsaktivitäten bei Stämmen entdeckt, welche in Habitaten mit niedrigem pH (pH < 6;

Burton & Prosser, 2001; de Boer & Kowalchuk, 2001; Tarre & Green, 2004) und damit weitaus geringeren NH3-Konzentrationen [pKa(NH3) = 9,25] vorzufinden sind. Basierend auf diesen Beobachtungen kann davon ausgegangen werden, dass N. europaea eines Ammoniaktransporters bedarf, um eine ausreichende hohe Aufnahme an NH3 zu ermöglichen.

Das Genom von N. europaea enthält in einer einzelnen Kopie das Gen (rh1), welches ein Transportprotein vom Rhesus-Typ kodiert. Rhesus-Gene kommen hauptsächlich in den Genomen von Archaeen, Pilzen, Pflanzen und Tieren vor und sind hingegen sehr selten in Bakterien zu finden (Chain et al., 2003; Huang & Peng, 2005, Cherif-Zahar et al., 2007). Da Proteine des Rhesus-Typs in eukaryotischen Systemen für einen bidirektionalen Transport

von Ammoniak verantwortlich sind (Marini et al., 2000; Westhoff et al., 2002; Ludewig, 2004; Mak et al., 2006; Mayer et al., 2006) liegt es nahe, dass das rh1-Gen in aktiv Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen transkribiert wird und dessen Genprodukt eine Funktion beim Transport von Ammoniak besitzt. Die Transkription von rh1 bei

„nitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ und bei „denitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“

(Definition siehe Abb. 19) wurde nachgewiesen, indem die Konzentration an rh1-nRNA unter den jeweiligen Wachstumsbedingungen bestimmt wurde. Hierzu wurden Nitrosomonas-Kulturen unter oxischen Bedingungen angezogen, nachfolgend für 336 Stunden unter anoxischen Bedingungen inkubiert und daraufhin wiederum oxischen Bedingungen ausgesetzt. Zu den in Abb. 19 ersichtlichen Zeiten wurde die Gesamt-RNA isoliert und die Menge an rh1-mRNA per „Slot-Blot“ bestimmt (Abb. 19; Weidinger er al., 2007).

Abbildung 19: Relative Transkription von rh1 bei „nitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“

(oxische Bedingungen, chemolithotrophe Ammoniakoxidation; Ammoniak als energielieferndes Substrat) und „denitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ (anoxische Bedingungen, heterotrophe Denitrifikation, Pyruvat als energielieferndes Substrat) (Weidinger et al., 2007). Alle Signale wurden bezüglich des höchsten Werts (t = 0 h) normiert. Das Experiment wurde mit aerob gewachsenen Bakterien gestartet, welche zum Zeitpunkt t = 0 h anoxischen Bedingungen ausgesetzt wurden (0-336 h; schwarze Balken).

Anschließend wurden die Bakterien erneut in oxische Bedingungen überführt (338-528 h;

weiße Balken). Die angegebenen Werte repräsentieren jeweils den Mittelwert aus vier unabhängig voneinander durchgeführten Messungen (± SD).

Die Ergebnisse zeigen, dass „nitrifizierende Nitrosomonas-Zellen“ das rh1-Gen im signifikanten Maße transkribieren. Die Transkription des rh1-Gens wird dagegen bei

„denitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ um bis zu 95 % gegenüber der maximalen Transkription bei nitrifizierenden Nitrosomonas-Kulturen“ reduziert. Eine Erhöhung beziehungsweise Verminderung der Ammoniumkonzentration im Medium der

„nitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ bewirkte indes keine bedeutsame Veränderung der Transkriptionsintensität (Weidinger et al., 2007).

Um die Auswirkungen der unterschiedlicher rh1-Transkriptionsintensitäten auf die Ammoniakaufnahmeaktivität zu untersuchen, wurden mittels [¹⁴C]-Methylammonium (MA) die Transportaktivitäten von „nitrifizierenden“ und „denitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“

bestimmt (Abb. 20; Weidinger et al., 2007).

Abbildung 20: Methylammonium (MA)-Aufnahme von N. europaea (Weidinger et al., 2007). Die MA-Konzentration wurde auf 10 mM und die Zelldichte auf 5 x 10⁹ Zellen ml^-1 [entspricht 0,8 (mg Protein) ml^-1] eingestellt. Die MA-Aufnahme wurde anhand von [¹⁴C]-MA bei „nitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ (●), „nitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ unter Zusatz von 20 µM L-Methioninsulfon (MSF) (∆) sowie bei „denitrifizierende Nitrosomonas-Zellen“ (□) gemessen. Die angegebenen Werte repräsentieren jeweils den Mittelwert aus fünf unabhängig voneinander durchgeführten Messungen (± SD).

Die MA-Aufnahmeaktivität von „denitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ liegt mit 23,3 ± 2,2 nmol MA (mg Protein)^–1 min^–1 ungefähr um das zehnfache niedriger als die MA-Aufnahmeaktivitäten von „nitrifizierenden Nitrosomonas-Zellen“ [252,7 ± 50,9 nmol MA (mg Protein^–1) min^–1]. „Denitrifizierende Nitrosomonas-Zellen“ haben im Vergleich zu

„nitrifizierender Nitrosomonas-Zellen“ einen erheblich geringeren Ammoniakbedarf, da sie Stickstoff nur als Baustoff für die Assimilation hochmolekularer Verbindungen und nicht als Substrat für die Energiegewinnung benötigten. Die Ergebnisse zeigen somit, dass sowohl die Transkription von rh1 als auch die Aktivität der MA-Aufnahme mit dem Ammoniakbedarf der Bakterien korreliert. Die Zugabe verschiedener Konzentrationen des Glutaminsynthetase-Inhibitors L-Methioninsulfon (0 – 20 µM MSF) beeinflusste die MA-Aufnahmeaktivitäten nicht (Abb. 20; Weidinger et al., 2007). Die Glutaminsynthetase ist in Escherichia coli für den Einbau von Ammonium in organisches Zellmaterial verantwortlich, und es konnte gezeigt werden, dass mit einer Hemmung der Glutaminsynthetase mit MSF auch die MA-Aufnahme zum Erliegen kam (Javelle et al., 2005). Die Resultate aus Abb. 20 lassen somit erkennen, dass bei N. europaea die Assimilation von Ammonium nicht mit dem Ammoniaktransport gekoppelt ist.

Für die Aufnahme von MA durch den Rhesus-Transporter konnte bei pH 7,25 ein Km-Wert von 1,8 ± 0,2 mM ermittelt werden (Abb. 21A, Weidinger et al., 2007). Der Km-Wert des Rhesus-Transporters von N. europaea liegt somit im Bereich der eukaryotischen Rhesus-Transporter (Marini et al., 2000; Ludewig, 2004). Zahlreiche Studien an Transportern des Rhesus-Typs deuten darauf hin, dass der ungeladenes Ammoniak und nicht das geladene Ammonium-Kation transportiert wird (Marini et al., 2000; Westhoff et al., 2002; Ludewig, 2004; Mak et al., 2006; Mayer et al., 2006). In N. europaea bleibt der errechnete Km-Wert bezüglich der ungeladenen Form von MA bei verschiedenen pH-Werten (6,75 - 8,25) nahezu konstant bei 1 µM, was vermuten lässt, dass in N. europaea ebenfalls die ungeladene Form von MA transportiert wird. Diese Annahme wird durch Messung der pH-abhängigen MA-Aufnahmeaktivität von Nitrosomonas-Kulturen bekräftigt. Die beobachtete MA-Aufnahmeaktivität steigt nahezu exponentiell mit dem pH-Wert an (Weidinger et al., 2007).

Die maximale Kapazität der Rh1-abhängigen MA-Aufnahme wird bei etwa 20 mM MA erreicht (pH 7,25). Eine weitere Erhöhung der MA-Konzentration hatte keine signifikant gesteigerte MA-Aufnahmeaktivität zur Folge.

Abbildung 21: Aufnahmekinetik von MA in N. europaea (Weidinger et al., 2007).

A: Korrelation zwischen MA-Aufnahme und MA-Konzentration bei pH 7,25.

(■) „Nitrifizierende Nitrosomonas-Zellen“; Der Km-Wert für MA war vom pH abhängig:

Km(pH 6,75) = 5,2 ± 0,9 mM; Km(pH 7,75) = 0,61 ± 0,3 mM; Km(pH 8,25) = 0,19 ± 0,08 mM.

Der K_m-Wert war jedoch unabhängig vom pH bei 1 µM wenn er für die ungeladene Form von MA berechnet wurde. (□) „denitrifizierende Nitrosomonas-Zellen. B: Hemmung der MA-Aufnahme durch Ammonium bei pH 7,25. (■) 10 mM MA; (∆) 5 mM MA; (●) 1 mM MA.

Alle angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus fünf unabhängig voneinander durchgeführten Messungen (± SD).

Die Aufnahme von MA durch den Rh1-Transporter wird kompetitiv durch Ammoniak gehemmt. Durch Aktivitätsmessungen in Gegenwart von verschiedenen Ammoniak-konzentrationen konnte ein K_i-Wert von 0,3 ± 0,1 mM bestimmt werden (Abb. 21B;

Weidinger et al., 2007). Die Beobachtung, dass durch Zugabe von Ammonium die MA-Aufnahme kompetitiv gehemmt wird, deutet darauf hin, dass beide Substanzen von einem gemeinsamen Transportprotein (Rh1), transportiert werden. Ein passiver Transport beider Substanzen über die Cytoplasmamembran würde naturgemäß zu keiner gegenseitigen Beeinflussung der Aufnahmeaktivitäten von Ammoniak und MA führen.

Um die Funktion des Rh1-Transporters als Ammoniaktransporter in N. europaea zu verifizieren, wurde das rh1-Gen in eine dreifach mep-defiziente Saccharomyces cerevisiae-Mutante (31019b; ∆∆∆mep1;2;3) kloniert und darin exprimiert (mep-Gene kodieren in S. cerevisiae für Methylammonium- und Ammonium-Permeasen). Sowohl zur Kontrolle als auch zum Vergleich wurde der aktive Ammoniumtransporter AtAMT1;1 aus Arabidopsis thaliana ebenfalls in die dreifach mep-defiziente S. cerevisiae-Mutante kloniert und exprimiert (Mayer & Ludewig, 2006). Die Wachstumsraten der S. cerevisiae-Stämme zeigen deutlich, dass das Rh1-Protein von N. europaea in der Lage ist, die Ammoniakaufnahme in S. cerevisiae zu unterstützen (Abb. 22; Weidinger et al., 2007).

Abbildung 22: Wachstum von mep-defizienten Saccharomyces cerevisiae-Stämmen mit exprimiertem Rh1-Protein aus Nitrosomonas europaea und dem AtAMT1;1 Ammonium-transporter aus Arabidopsis thaliana (Weidinger et al., 2007). Von links nach rechts sind jeweils 10-fache Verdünnungen der jeweiligen S. cerevisiae-Kultur aufgetragen.

A, B: Wachstum eines Ammoniumtransporter-defizienten S. cerevisiae-Stammes (31019b;

∆∆∆mep1;2;3) mit transformiertem AtAMT1;1 (pDR-ArAMT1;1), leerem pDR-Plasmid (pDR), oder transformiertem Rh1 (pDR-Rh1). Dem YNB-Nährmedium (pH 5,5) wurden jeweils 1 mM (A) oder 5 mM NH4Cl (B) zugesetzt. C: Wachstum eines Wildtyp S. cerevisiae-Stammes mit transformiertem AtAMT1;1 (ArAMT1;1), leerem pDR-Plasmid (pDR), oder transformiertem Rh1 (pDR-Rh1). Dem YNB-Nährmedium (pH 5,5) wurde 125 mM MA zugesetzt.

Die Expression von Rh1 verbesserte bei einer Ammoniumkonzentration von 5 mM das Wachstum des Ammoniumtransporter-defizienten S. cerevisiae-Stammes signifikant, wenn-gleich das Wachstum des mit AtAMT1;1-transformierten Stammes deutlich besser war (Abb. 22B). Die Expression von Rh1 im Wildtyp S. cerevisiae-Stamm verlieh diesem eine Resistenz gegen das toxische MA (Abb. 22C). Im Gegensatz zu den Methylammonium- und Ammonium-Permeasen von S. cerevisiae sind Rhesus-Proteine aufgrund der bidirektionalen

Transportercharakteristik (Marini et al., 2000; Westhoff et al., 2002; Ludewig, 2004; Mak et al., 2006; Mayer et al., 2006) in der Lage, MA auch wieder aus dem Zellinneren hinaus zu transportieren und so die MA-Konzentration in den Zellen niedrig zu halten. Demnach schützt Rh1 S. cerevisiae vor hohen toxischen MA-Konzentrationen.

In vielen Mikroorganismen ist die Aufnahme einer bestimmten Substanz direkt mit ihrem Verbrauch verknüpft (Javelle et al., 2005). Um eine mögliche Kopplung der MA-Aufnahmerate mit der Ammoniakoxidationsaktivität nachzuweisen, wurde der Einfluss einer AMO-Hemmung durch Acetylen auf die MA-Aufnahmeaktivität von N. europaea untersucht.

Als erstes wurde hierzu die ATP- und NADH-Konzentration von „frischen“ und

„hungernden“ Zellen bestimmt (Definition siehe Abb. 23, Weidinger et al., 2007). Während

„frische Zellen“ eine ATP-Konzentration von 6,9 ± 0,5 µmol ATP (g Protein)^-1 und eine NADH-Konzentration von 8,8 ± 1,3 µmol NADH (g Protein)^-1 aufwiesen, war sowohl die ATP- als auch NADH-Konzentration in „hungernden Zellen“ beträchtlich geringer [0,1 µmol ATP (g Protein^-1) und 0,3 µmol NADH (g Protein^-1)].

Abbildung 23: Aufnahme von MA durch N. europaea mit aktiver oder durch Acetylen gehemmter AMO (Weidinger et al., 2007). Die MA-Konzentration wurde auf 10 mM und die Zelldichte auf 5 x 10⁹ Zellen ml^-1 (entspricht 0,8 mg Protein ml^-1) eingestellt. Der pH betrug 7,25. (■) MA-Aufnahme von „frischen Zellen“ (Zellen befanden sich vor Beginn des Versuches in einem Kulturmedium mit 25 mM Ammonium); (∆) MA-Aufnahme von

„Acetylen-gehemmten Zellen“; (●) MA-Aufnahme von „hungernden Zellen“ (Zellen wurden 5 Stunden vor Beginn des Versuches in ein Ammonium-freies Kulturmedium überführt) (□) MA-Aufnahme von „hungernden, Acetylen-gehemmten Zellen“.

Die MA-Aufnahmeaktivität von „Acetylen-gehemmten Zellen“ (Aktivität der AMO vollständig durch Acetylen gehemmt) unterscheidet sich nicht von der MA-Aufnahmeaktivität

„frischer Zellen“. Die MA-Aufnahmeaktivität der „hungernden Zellen“ war im Gegensatz zur MA-Aufnahmeaktivität der „Acetylen-gehemmten Zellen“ sowie der „frischen Zellen“ in der ersten Minute allerdings deutlich geringer. Innerhalb der ersten Minute sank bei den

„hungernden Zellen“ der periplasmatische pH auf einen Wert unter 6, gefolgt von einem Anstieg der MA-Aufnahmeaktivität (Minute 2 bis 4, Abb. 23). Im Gegensatz dazu verminderte sich der pH im Periplasma von „hungernden, Acetylen-gehemmten Zellen“ nicht und die MA-Aufnahmeaktivität blieb während des gesamten Experimentes stets gering (Abb.

23; Weidinger et al., 2007). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aufnahmeaktivität des Rh1-Transporters nicht von der Ammoniakoxidationsaktivität (und damit folglich der ATP- und NADH-Konzentration) der Zelle beeinflusst wird und dass ein niedriger pH im Periplasma benötigt wird (pH < 6), um hohe MA-Aufnahmeaktivitäten zu ermöglichen.

Schmidt et al. (2004a) fanden heraus, dass Nitrosomonas-Zellen in der Lage sind, intrazellulär Ammonium in Konzentrationen bis zu 1 M zu akkumulieren. Diese Akkumulation kann jedoch nicht alleinig durch die Aktivität des Rh1-Transporters erklärt werden, da der Rh1-Transprorter nur einen passiven Transport von Ammoniak und somit maximal einen Konzentrationsausgleich zwischen Medium und Cytoplasma ermöglicht.

Während festgestellt wurde, dass das Membranpotential sowie die ATP- und NADH-Konzentration der Zelle keinen direkten Einfluss auf den Ammoniaktransport und die Ammoniumakkumulation besitzt, scheint jedoch der pH im Periplasma sowie der pH im Medium einen entscheidenden Faktor für die Ammoniumakkumulation darzustellen (Weidinger et al., 2007). Eine Erniedrigung des pH im Periplasma ist dabei mit einem signifikanten Anstieg der MA-Aufnahmeaktivität verbunden. Der pH-Wert des Mediums (pH 7 - 8) unterscheidet sich von dem periplasmatischen pH aktiv Ammoniak-oxidierender Nitrosomonas-Zellen (pH < 6) um bis zu drei pH-Einheiten. Dieser pH-Unterschied könnte eine Akkumulation von Ammonium um einen Faktor bis zu 10³ im periplasmatischen Raum bewirken (Schmidt et al., 2004a, Weidinger et al., 2007). Durch diese „Säurefalle“ könnte Ammonium in hohen Konzentrationen im Periplasma angehäuft, und mittels Rh1 in Form von Ammoniak in das Cytoplasma (pH 7 - 8; Kumar & Nicholas; 1983) transportiert werden (Gilch et al., 2009a). Die periplasmatische „Säurefalle“ könnte es N. europaea an Habitaten mit geringen Ammoniumkonzentrationen ermöglichen, erfolgreich mit anderen (heterotrophen) Mikroorganismen und Pflanzen um die Ressource Ammonium zu konkurrieren. Der Vorteil, nach längerer Hungerphase bereits in der lag-Phase sehr schnell

Ammonium durch eine Erniedrigung des periplasmatischen pH aufnehmen und akkumulieren zu können, könnte zudem ein entscheidender Faktor sein, warum sich N. europaea trotz seiner längeren Generationszeit und seines passiven Ammoniak-Transportsystems gegenüber den schnell wachsenden heterotrophen Bakterien mit aktiven Ammoniak-Transportsystemen (z. B. Stämme der Genera Escherichia, Corynebacterium oder Bacillus; Siewe et al., 1996;

Javelle et al., 2005) im Wettstreit um die Ressource Ammonium behaupten kann.

4.3 Transkriptionelle Regulation von Schlüsselenzymen des Energiestoffwechsels von