Aufbau des Systems zur monaxenischen Kultur von Tomatenkeimlingen Das Pflanzenwachstum musste für die hier aufgeführten Versuche über einen längeren

Zeitraum unter sterilen Bedingungen erfolgen, damit die Messung der Exsudation organi-scher Säuren nicht durch mikrobiellen Abbau beeinflusst wird. Bevor die eigentlichen Ve r-suche stattfinden konnten, mussten die Samen der Versuchspflanze unter sterilen Bedin-gungen zum Keimen gebracht werden. Diese Anzucht in den Keimröhren diente auch da-zu, dass die Keimlinge die Phosphorvorräte aus dem Samen ausschöpfen und sich so im Versuchsverlauf ein Phosphormangel bei den Pflanzen einstellen konnte. Durch das in Ab-schnitt 4.2.1.2 beschriebene Kultursystem ist ein Wachstum der Versuchspflanzen für bis zu acht Wochen unter sterilen Bedingungen möglich. Die weiteren folgenden Eigenschaf-ten sollte das Kultursystem gewährleisEigenschaf-ten:

Ø Eine sterile Kultur der Pflanzen über einen Zeitraum von mehreren Wochen.

Ø Eine gute Durchwurzelbarkeit des Substrates für ein uneingeschränktes Wurzelwachs-tum.

Ø Ein geringes Volumen, so dass bei ausgeprägtem Wurzelwachstum das gesamte Sub-strat als wurzelnahes SubSub-strat betrachtet werden kann.

Ø Eine Belüftung zur Vermeidung anoxischer Zustände.

Ø Eine verletzungsarme Gewinnung der Lösungen.

Als Substrat für die Versuche im Kultursystem wurde Quarzsand gewählt. Nach SIMONS et al. (1996) liefert Quarzsand der Korngröße 0,1 bis 0,3 mm eine gute Durchwurzelbarkeit für Tomatenwurzeln und damit die besten Wachstumsbedingungen für diese Art. Werden kleinere Partikel verwendet, ist das Wurzelwachstum aufgrund der geringen Porengröße eingeschränkt, sind die Partikel zu groß, so trocknet das Substrat zu schnell aus. In einem Vorversuch ergab eine Mischung aus einem Drittel Grobsand (Durchmesser 0,63 bis 2,0 mm) und zwei Dritteln Mittelsand (Durchmesser 0,2 bis 0,63 mm) ein optimales Ver-hältnis im Substrat für die Wurzelentwicklung der hier verwendeten Tomatensorte 'Freude'.

Das Beimischen von Grobsand sorgte für eine Lockerung des Substrates. Neben einer aus-reichenden Verzweigung und Wurzelhaarbildung war eine Perkolation des Substrates zur Probenahme möglich.

Für das Kultursystem wurden Röhren mit einem Durchmesser von 4 cm und einer Länge von 22 cm gewählt. Zum einen gewährleistet der verwendete Durchmesser der Röhren, dass sich die Sprosse der jungen Pflanzen in der Entwicklung nicht gegenseitig bedrängen.

Zum anderen wird dadurch das Substrat in einem geringen Volumen untergebracht und ein Längenwachstum der Wurzeln ermöglicht. Aufgrund des starken Wurzelwachstum kann der gesamte Inhalt als wurzelnaher Boden bzw. wurzelnahes Substrat betrachtet werden.

Der Ausdruck Rhizosphärenboden oder –substrat wird dagegen vermieden, da der Begriff der Rhizosphäre von HILTNER (1904) geprägt wurde und „die enge Zone bakterieller Akti-vität um eine Wurzel“ beschreibt. Diese Definition wurde von DARRAH (1993) zwar er-weitert, indem „der von den Wurzeln beeinflußte Bereich des Bodens“ angesprochen

wur-auf mehrere Zentimeter auszudehnen ist. Dennoch wird das Substrat aus den Kulturröhren als wurzelnahes Substrat bezeichnet, um Mißverständnissen vorzubeugen.

Eine Belüftung des Kultursystems war notwendig, um anoxische Zustände im Bereich der Wurzeln zu vermeiden, da sich Sauerstoffmangel nicht nur auf das Wurzelwachstum, son-dern auch auf die Wurzelexsudation auswirkt (RICARD et al., 1994 IN: JONES, 1998). Die beiden eingesetzten Mikroorganismenisolate zählen zu den Aerobiern und sollten deswe-gen ebenfalls nicht anoxischen Bedingundeswe-gen ausgesetzt werden. Das Substrat wurde aus diesem Grund von unten mit kohlendioxidverarmter Luft durchströmt. Der Sprossbereich im Kultursystem wurde mit steriler Raumluft belüftet.

Die Röhren des Kultursystems wurden in einer Klimakammer oder einem Klimaschrank unter definierten Bedingungen (Abschnitt 3.4.1) inkubiert.

4.2.1.1 Aufbau der Röhren

Unter Ableitung des Versuchsaufbaus von LIPTON et al. (1987) und SIMONS et al. (1996) entstand folgendes System (Abbildung 6) bestehend aus zwei aufeinandergesetzten Glas-röhren. Die untere Röhre dient als Wurzelraum, die obere als Sprossraum. Das mit ca.

200 g Sand gefüllte untere Glasrohr (Länge 22 cm, ∅ 4 cm, Schmidt & Co, Braunschweig) wird nach unten mit einem Schraubverschluss mit Silikondichtung verschlossen. Vor dem Befüllen wird der Sand der Röhren mit einer Nährlösung und den entsprechenden Phos-phatdüngungsstufen bzw. mit an Goethit sorbiertem Phosphat versetzt. Für die Be- und Entlüftung sorgen zwei an der Seite aufgesetzte sterile Luftfilter (Roth, Karlsruhe, nicht eingezeichnet). Durch den unteren Luftfilter wird Luft gepumpt, die durch 3 M Kalilauge geleitet und so an Kohlendioxid verarmt wurde. Durch den oberen Luftfilter kann Luft entweichen. Die regelmäßige Zugabe von Wasser alle zwei bis drei Tage, erfolgt in der reinen Werkbank über den oberen Zugang.

Auf der entgegengesetzten Seite der Röhre liegt ein weiterer Zugang mit Luftfilter. Von diesem führt ein dünner Silikonschlauch in das Innere der Glasröhre bis auf den Boden des Gefäßes. Damit der Sand den Schlauch nicht verstopfen kann, liegt das Ende des Schlau-ches in einer Schicht von 30 g Glasperlen (∅ 4 mm, Merck, Darmstadt). Diese wird mit einer Lage Steinwolle (2 g Teka-Watte, Lorch, Waldenbach) vom Sand getrennt. Über diesen Schlauch kann Flüssigkeit sowohl zugeführt als auch abgezogen werden. An den Seiten der Röhre, auf der Höhe der Luftfilter, sowie oben als Manschette, verlaufen Strei-fen von Filterpapier (Typ 2048, Schleicher & Schuell, Dassel), um ein Austrocknen der oberen Sandschichten zu verhindern (nicht in Abbildung 6 eingezeichnet). Die gefüllten Röhren werden zweimal autoklaviert. Für den Sprossraum werden identische Röhren ohne Füllung und mit Silikonstopfen ebenfalls autoklaviert. Sie werden nach dem Einsetzen der Pflanzen mit der Öffnung nach unten auf die mit Sand gefüllten Röhren gesetzt.

Nach sieben bis zehn Tagen werden die Keimlinge in der sterilen Werkbank vorsichtig von dem Filterpapier der Keimröhren befreit und drei bis vier Pflanzen pro Röhre direkt in den Sand am oberen Ende der Versuchsröhren gesetzt. Die Sterilität der Keimröhren wird an einigen Keimlingen, die auf einem Vollnährmedium ausgelegt werden, überprüft. An-schließend wird eine zweite leere Röhre über den Spross gestülpt und mit Parafilm mit der unteren Röhre verbunden. Die bepflanzten Versuchsröhren werden in die Klimakammer bzw. den Klimaschrank überführt.

Sowohl der Wurzel- als auch der Sprossbereich werden über ein Pumpensystem mit Luft versorgt, die über Sterilfilter geleitet wird. Dem Sprossbereich wird mit Raumluft, kohlen-dioxidhaltige Luft zugeführt. Dabei muss anfangs die Luftzufuhr zum Sprossbereich sorg-fältig reguliert werden, um ein Austrocknen der Keimlinge zu verhindern. Der Wurzelbe-reich wird mit Luft versorgt, die durch 3 M Kalilauge geleitet und so an Kohlendioxid ver-armt wurde. Im Verlauf der Versuche kommt es zu einer starken Durchwurzelung des Sub-strates, so dass der Inhalt der unteren Röhre als wurzelnahes Substrat angesehen werden kann. Im Dreiblattstadium der Pflanzen, werden die Lösungen aus dem Substrat gesammelt und anschließend die Pflanzen geerntet. Das Dreiblattstadium der Pflanzen ist ca. sieben Wochen nach dem Keimansatz in den Röhren erreicht.

Abbildung 6: Schematische Darstellung des Kultursystems zur sterilen und störungsarmen Probenahme unter streng definierten Bedingungen. (Genaue Beschreibung siehe Text).

CO2 verarmte Luft

Entnahme der Lösun-gen GL, AuL und EP durch Silikonschlauch CO2 haltige Luft

Sand

Glasperlen Steinwolle Luftausgang

Silikonstopfen

Luftausgang

Filterpapierstreifen Filterpapierstreifen

4.2.1.2 Probenahme

Zunächst werden die exsudathaltigen Lösungen aus dem Kultursystem (Abschnitt 3.4.3) in der reinen Werkbank gewonnen. Die Zugabe von deionisiertem Wasser zur Perkolation des Substrates erfolgt seitlich und am oberen Ende der Röhre. Hier passiert das Wasser zuerst einen Filterpapierstreifen und einen Teil des nährsalzhaltigen Substrates bevor es in Kon-takt mit den Wurzeln gelangt. Deswegen führt der Einsatz von deionisiertem Wasser zur Spülung des Substrates und Sammlung der Exsudate in diesem Kultursystem nicht zu ei-nem erhöhten Verlust von Ca²⁺ und anderen Ionen des Apoplasten. Ein Aufbrechen der Zellmembranen wird durch die Art der Probenahme weitestgehend verhindert.

Bei den Versuchen mit Pflanzen werden diese vorsichtig aus dem Sand gezogen und die Wurzeln mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (3 ml) abgespült. Diese Lösung wird als Rhizoplanenlösung, RhL, bezeichnet. Alle Lösungen werden mit sterilen Spritzen ge-wonnen und in sterile Schraubdeckelgefäße überführt. Für die Überprüfung der Sterilität bzw. zur Bestimmung der cfu der Mikroorganismen, wird aus einem Aliquot der abgezo-genen Lösungen (GL, AuL, EP), bzw. in den Versuchen mit Rhizosphärenmikroorganis-men aus einem Teil der Rhizoplanenlösung (RhL), eine Verdünnungsreihe erstellt. Die Verdünnungen werden auf Vollnährmedien (Abschnitt 3.8.3.1) ausplattiert.

Während alle bisher erwähnten Arbeiten an der reinen Werkbank durchgeführt werden, erfolgen die weiteren Arbeiten unter unsterilen Bedingungen. Der Sand wird aus den Röh-ren geschüttelt, um auch die Feinwurzeln zu erfassen. Die Pflanzen werden in Spross und Wurzeln unterteilt und deren Frisch- und Trockenmassen bestimmt. Der Sand, die Glasperlen, die Steinwolle und die Filterstreifen werden in Szintillationsgefäßen zunächst bei -20°C eingefroren, später nach RIEHM (Abschnitt 3.5.3) auf pflanzenverfügbares, DL-lösliches Phosphat untersucht.