Aufarbeitungsschema fü Seewasserproben - Bezeichnung der Fraktionen und Komponenten

In Abb.4 ist die Reihenfolge der einzelnen Schritte bei der Aufarbeitung der Proben sowie die Benennung der Fraktionen und Komponenten angegeben.

Tiefe-Temperatur- 1 L Probe Salzgehalt

Chlo7tyll a

)Q;ltratF-< Konservierung gelöste anorg.

Stickstoff DIN

partikuläre org. gelöste org.

Material POM

t I

1

H y d y l y s e

1 1

^Hy$rolyse

1

Gesamte gelöst AA gelöste org. Stickstoff

à ‘ I

hydrophobe, saure NaOH 0.2 N

Hydrolyse

1

T

hydrophobe, neutrale Methanol yÑÑ I I

A A - H ~ N ) + Hydrolyse

1

Abb.4: Aufarbeitungsschema fü Seewasserproben

3.2 Untersuchung der Proben der Algenkultur 3 . 2 . 1 Algenmaterial und Kulturbedingungen

Die Diatomeenart Thalassiosira antarctica (SK 1) stammte von der Expedition ANT 1x12 (1992) und wurde bei Position S 63015';W 58020' von Dr. M. Baumann (Alfred-Weaener-Institut, Bremerhaven) isoliert. Fü die Versuche wurde die Impfkultur in einem Kühlkontaine bei einer Temperatur von 0OC und einer Beleuchtung von ca. 100 m ~ - m - 2 . s - 1 in einer Nährlösu nach Stosch & Drebes (1964) gehältert bis ein deutlicher Anstieg der Biomasse zu beobachten war. Im Anschluà wurde die Impfkultur mit dem Kulturmedium mehrmals gewaschen, um den Anteil der mit EDTA versetzten Nährlösu so gering wie möglic zu halten.

Beim Ansetzen des Kulturmediums wurde darauf geachtet, keine künstliche Substanzen zuzusetzen, die die Huminstoffbildung beeinflussen konnten (z.B. wie EDTA durch Komplexbildung). Antarktisches "Brauneis", dessen braune Farbe auf einem große Anteil von eingeschlossenem Algenmaterial beruht, wurde im Kühlschran bei 5OC aufgetaut und anschließen übe 0,22 u m Zelluloseacetatfilter (Sartorius) mit Unterdruck filtriert. Ein Teil des Filtrats und der Filter wurde, ebenso wie die Proben, die im Verlauf des Versuchs aus der Kultur entnommen wurden, fraktioniert und analysiert. Als Kulturmedium dienten 18 L gealtertes, antarktisches Tiefenwasser (filtriert) von der Polarstern-Expedition ANT 1x12, das in einer 20 L Glasflasche mit 2 L "Brauneisfiltrat" vereinigt wurde und vor dem Beimpfen mit der Algenkultur mehrere Tage bei den spätere "Start1'- Bedingungen (0±1OC Dauerbeleuchtung) aufbewahrt wurde.

3 . 2 . 2 Probennahme und Aufarbeitungsschema

Währen einer 19 Tage andauernden "Wachstums1'-Phase mit permanenter Beleuchtung erfolgte die Probennahme von Ca. 250 mL Probenlösun an jedem 2.

Tag. Um das Wachstum der Zellen nicht zu beeinflussen, wurde im allgemeinen auf ein Bewegen der Lösun verzichtet, lediglich vor jeder Probennahme wurde das Medium mechanisch durchmischt. Nach Erreichen der stationäre Phase wurde die Kultur ab dem 19. Tag im Dunkeln gehalten:. Im Anschluà erfolgten zunächs zwei Probennahmen im Abstand von 6 Stunden, anschließen wurden die Intervalle zwischen den Probennahmen allmählic auf bis zu 3 Wochen erhöht Der Versuch wurde am 85. Tag abgebrochen, die verbliebene Probe auf 8 Erlenmeyerkolben verteilt und das Verhalten der Zellen nach Zugabe verschiedener Nährstofflösung und erneutem Einschalten des Lichts beobachtet.

Ca. 30 mL der Probenlösun wurden zur Bestimmung der Bakterienzahl in ein steriles Gefä überführ Weitere 30 mL wurden zum Auszähle der Diatomeenzellzahl entnommen und zur Konservierung mit 1,5 mL 20%iger (mit Hexamin gepufferter) Formalinlösun versetzt. Im Anschluà wurden ca. 250 mL Probe entnommen und entsprechend dem nachfolgenden Schema weiterverarbeitet:

200-250 mL Probe wurden filtriert. Die Filter wurden nach jeweils 50 oder 100 mL Probe (s.u.) gewechselt, das Filtrat wurde im Filtrationsgefä gesammelt.

Es wurden folgende Bestimmung durchgeführt

-

Am Rückstand

Filter von 50 mL Probe : Bestimmung der PAA

Filter von 50 mL Probe : Fraktionierung des partikuläre Materials Filter von 100 mL Probe: Bestimmung des chl a

-

Am Filtrat:

10 mL Filtrat: Bestimmung der FAA 10 mL Filtrat: Bestimmung der TDAA 10 mL Filtrat: Bestimmung des DIN 10 mL Filtrat: Bestimmung des DON

100 mL Filtrat: Fraktionierung des DOM übe XAD-2

Im Gegensatz zu den Methoden der Feldproben wurden fü die XAD-2- Fraktionierung von DOM, fü die Extraktion der Fraktionen sowie fü die DON- Bestimmungen die Volumina verkleinert: in die Säule wurden 5 mL XAD-2 eingebracht; die Fließgeschwindigkeite von Probe und Eluenten blieben unverändert Zur Fraktionierung wurden 100 mL Probe (mit pH = 2) auf die Säul gegeben. Die Elution erfolgte zuerst mit 25 mL NaOH (0,2 M) und anschließen mit 25 mL Methanol. Das NaOH-Eluat wurde mit 5 mL Boratpuffer neutralisiert; das Methanoleluat wurde auf wenige pL eingeengt, mit 25 mL NaOH aufgenommen und ebenfalls mit 5 mL Boratpuffer neutralisiert. Die DON-Bestimmung erfolgte mit 5 mL Probe und 1,25 mL Aufschlußreagenz

Die Bestimmung der Bakterienzahl erfolgte durch Ansetzen von Bakterienkulturen auf Agarnährböd und anschließende Auszähle der Kolonien. Mit dieser Methode wird die Zahl der lebenden aktiven Bakterien bestimmt, die auf Agar wachsen, und die somit Trends im Zustand und der Aktivitä der Heterotrophen widergespiegelt (K. Lochte, pers. Mitteilung). Allerdings wird lediglich ein Teil der vorhandenen Bakterienbiomasse erfaßt

3 . 2 . 2 . 1 Fraktionierung des partikuläre Materials

Nach der Probennahme wurden die zur Fraktionierung bestimmten Filter bis zur Aufarbeitung in Glasröhrche bei -20OC gelagert. Zur Trennung der Monomeren/Peptid"-Fraktion von der "Protein"-Fraktion und einer NaOH- unlösliche Fraktion wurden die Filter zwei unterschiedlichen Extraktionsverfahren unterzogen. Abb.5 zeigt das Aufarbeitungsschema und erläuter gleichzeitig die Bezeichnung der einzelnen Fraktionen.

1

Potter 1500 U/rnin

I

PAA/TCA =

PAA/NaOH =

Proteine

+

Rest Rest

Monomere Monomere

1

^FAA

1-<

_{+Peptide +Peptide} ^FAA

+Proteine

-4

^TDAA

1

Y t

1

^{P H 2}

1

incl.Proteine

AA-HbA AA-H bA

AA-H bN AA-H bN

Abb.5: Schema zur Aufarbeitung des partikuläre Materials

Um mit dem vorhandenen Material beide Extraktionsverfahren durchführe zu können wurden Filter aus zeitlich aufeinanderfolgenden Probennahmen jeweils alternierend mit TCA und NaOH extrahiert.

Zur Extraktion wurde der aufgetaute Filter mit dem partikuläre Material zusammen mit 10 mL kalter TCA (10%) in ein Potterröhrche gegeben und 5 min homogenisiert (1500 Ulmin). Zur Fällun kleiner Proteinmengen wurde anschließen 1 mL Natriumdeoxycholat-Lösun (DOCH, 0,15% wlv) zugegeben (Bensadoun & Weinstein, 1976; Clayton et al., 1988). Alternativ wurde der aufgetaute Filter mit 10 mL NaOH (0,025 M) in ein Potterröhrche gegeben und 5 min homogenisiert (1500 Ulmin). Vor der Filtration übe GF/C-Filter wurden die Homogenate beider Extraktionsmethoden einige Stunden stehengelassen. In den Rückständ wurden PAA bestimmt. Das Filtrat wurde mit Milli-Q-Wasser auf 100 mL aufgefüllt In dieser Lösun wurden FAA und TDAA bestimmt. 80 mL des Filtrats wurden auf pH 2 eingestellt und übe XAD-2 fraktioniert. AA-HbN und AA-HbA wurden bestimmt.

Die Konzentrationsberechnung fü die einzelnen lösliche Fraktionen der Aminosäure im partikuläre Material erfolgte sowohl aus den gelöste als auch aus den unlösliche Anteilen nach der Fraktionierung.

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