Assoziation von HSPs mit dem Cytoskelett in Neuronen und

HSPs sind wichtig für die Regulation des Cytoskeletts. Es gibt viele Untersuchungen, in denen die Bindung von HSPs mit Mikrotubuli (MT), Intermediärfilamenten, Mikrofilamenten und mikrotubuli-assoziierten Proteinen nachgewiesen wurde.

3.2.4.1 Mikrotubuli in Neuronen und Astrozyten nach HS und OS in vitro

Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz wurde die Verteilung der MT in kultivierten Neuronen und Astrozyten untersucht. Die MT wurden mit Antikörpern gegen α-Tubulin und sekundären FITC-gekoppelten Antikörpern

Ergebnisse 58 detektiert und im Fluoreszenzmikroskop mit angeschlossener Kamera aufgenommen.

Neurone besitzen ein ausgeprägtes MT-Netzwerk. Da die Neuronen-Kulturen jedoch empfindlich gegenüber der Durchführung dieser Methode sind und zudem auf Coverslips aus Glas nicht optimal wachsen, kann es mitunter bereits bei Kontrollbedingungen zu Störungen der MT-Organisation kommen. Nach Stress sind die Schädigungen jedoch deutlich ausgeprägter. Feine Verästelungen der neuronalen Fortsätze gehen verloren, manche Zellen scheinen besonders nach OS nur noch aus dem Zellsoma zu bestehen.

Zusätzlich sind Zelltrümmer auf dem Untergrund zu beobachten (Abb. 18c).

Astrozyten hingegen weisen auch nach Stress ein intaktes MT-Netzwerk auf.

Ein hochorganisiertes Netzwerk durchzieht die ganze Zelle, deutlich ist das Mikrotubuli-organisierende Zentrum (MTOC) zu erkennen (Abb. 18e). Nach OS machen sich erste Schädigungen bemerkbar, die MTs scheinen nicht mehr vollständig geordnet (Abb. 18f).

Neurone reagieren also unter Stresseinwirkung deutlich empfindlicher mit Änderungen der MT-Organisation, während das MT-Netzwerk von Astrozyten noch unbeeinträchtigt ist.

Abb. 18: Immunfluoreszenz-Darstellung des Tubulin-Netzwerks in Neuronen und Astrozyten nach Stress. Die Zellen wurden 24h nach HS (44°C, 30 min; b+e) oder OS (H2O2, 50µM; c+f) mit Methanol fixiert und mit anti-α-Tubulin markiert. Kernfärbung erfolgte mit DAPI (blau). Neuronen: a-c, Astrozyten: d-f. a+d: unbehandelte Kontrollen Balken = 20µm

Ergebnisse 59 3.2.4.2 Colokalisation von HSP25 mit Mikrotubuli

Die Immunfluoreszenz-Aufnahmen in Abb. 19 bestätigen, dass HSP25 in Neuronen nach HS nur schwach und nach OS nicht nachweisbar ist (s. Abb.

15). Die diffuse Verteilung von HSP25 in der Zelle lässt vermuten, dass hier keine Assoziation mit dem Cytoskelett vorliegt.

Abb. 19: Immunfluoreszenz-Darstellung von HSP25 in Neuronen. Die Zellen wurden 24h nach Stress mit Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1% Triton permeabilisiert. Die Detektion von HSP25 erfolgte mit einem polyclonalen AK (rot).

Kernfärbung mit DAPI (blau). Balken = 20µm. Co: unbehandelte Kontrolle, HS:

Hitzestress, OS: oxidativer Stress. n=4

In Astrozyten, die einen hohen konstitutiven Level von HSP25 haben, ist nach Stress nur eine geringe Zunahme von HSP25 zu beobachten. HSP25 befindet sich in der gesamten Zelle verteilt. In Bereichen, in denen das Cytoskelett dichter ist, lässt sich auch eine deutlichere Immunreaktivität von HSP25 detektieren (Abb. 20 + Abb. 21). HSP25 colokalisiert vermutlich mit GFAP (Abb.

20). Das GFAP-Netzwerk reicht allerdings nicht bis in die Zellperipherie. In den feineren Fortsätzen ist es nicht zu detektieren. Da dort aber noch HSP25 nachzuweisen ist, assoziiert das sHSP wahrscheinlich mit weiteren Cytoskelett-Komponenten. Abbildung 21 zeigt, dass HSP25 auch mit den MT colokalisiert vorliegt. Die Immunreaktivität von HSP25 reicht genauso weit in die

Ergebnisse 60 Zellperipherie wie die von α-Tubulin. Dies ist in den vergrößerten Ausschnitten deutlicher zu sehen (Abb. 20b, 21b).

Abb. 20: Immunfluoreszenz-Darstellung von GFAP und HSP25 in Astrozyten.

Astrozyten wurden 24h nach Stress mit Paraformaldehyd fixiert, permeabilisiert und mit anti-HSP25 (rot) und anti-GFAP (grün) markiert. Die Zellkerne sind mit DAPI angefärbt (blau). b) zeigt eine vergrößerte Darstellung aus a). Balken = 20µm. Co: unbehandelte Kontrolle, HS: Hitzestress, OS: oxidativer Stress. n=3

Ergebnisse 61

Abb. 21: Colokalisation von HSP25 und α-Tubulin in Astrozyten. Die Zellen wurden 24h nach Stress der indirekten Immunfluoreszenz unterzogen. Doppelfärbung mit α-Tubulin (grün) und HSP25 (rot), Kernfärbung mit DAPI (blau) b) Vergrößerungen von Ausschnitten der overlay-Bilder aus a). Balken = 20µm. Co: unbehandelte Kontrolle, HS: Hitzestress, OS: oxidativer Stress. n=3

HSP25 ist in Astrozyten hauptsächlich mit den MT assoziiert. Es besteht wahrscheinlich auch eine Interaktion mit GFAP, diese ist jedoch nicht so vollständig wie die mit den MT. In Neuronen kann auch nach Stress keine Colokalisation von HSP25 mit den MT beobachtet werden (Abb. 19).

3.2.4.3 Assoziation von HSPs mit MT in Neuronen und Astrozyten in vitro

Zur weiteren Analyse der Bindefähigkeit von HSPs an MT wurde ein MT-Binding-Assay durchgeführt. Die MT wurden nach Stabilisierung mit Taxol isoliert. Dies ermöglicht im Immunoblot die Analyse von Proteinen, die an MT gebunden sind. Die Ergebnisse des MT-Binding-Assays sind in Abb. 22 dargestellt.

Unter Kontrollbedingungen sind in Neuronen nur HSP90, welches vorwiegend cytosolisch vorkommt, und geringe MT-gebundene Mengen HSP25 zu detektieren. In Astrozyten dagegen kommen unter Kontrollbedingungen HSP90, HSP32, HSP25 und αB-Crystallin vor. Alle HSPs sind gebunden an die MT,

Ergebnisse 62 wobei HSP25 zum Teil auch im Cytosol vorkommt. HSP90 liegt in Astrozyten gleichermaßen MT-gebunden und ungebunden vor. Nach HS kommt es in Neuronen und Astrozyten zur Induktion von HSP70, HSP25 und αB-Crystallin.

Dabei liegt HSP70 in beiden Zelltypen zum größten Teil cytosolisch vor, zeigt aber auch eine Assoziation mit MT. HSP25 befindet sich vorwiegend MT-assoziiert, kommt aber zum Teil auch im Cytosol vor. In beiden Zelltypen ausschließlich in der MT-Fraktion zu detektieren ist αB-Crystallin. Nach OS kommt es in Neuronen und Astrozyten zur Induktion von HSP32 und αB-Crystallin. Während beide HSPs in Neuronen ausschließlich MT-gebunden sind, ist HSP32 in Astrozyten zu einem geringen Anteil auch im Cytosol zu detektieren. Die HSP90-Menge nimmt nach OS in Neuronen und Astrozyten ab.

Abb. 22: Analyse des Bindungsverhaltens von HSPs an Mikrotubuli in Neuronen und Astrozyten. Die Zellen wurden behandelt und die Zelllysate in eine cytoskelettale (PE) und in eine lösliche Fraktion (SN) aufgetrennt. Die Zellfraktionen von Neuronen (A) und Astrozyten (B) wurden 24h nach Stress der Immunoblot-Analyse unterzogen.

Co: unbehandelte Kontrolle, HS: Hitzestress, OS: oxidativer Stress. n=3

Die Ergebnisse des MT-Binding-Assays bestätigen die in Astrozyten mit der indirekten Immunfluoreszenz beobachtete Colokalisation von HSP25 (s.

3.2.4.2). HSP25 ist sowohl nach Stress als auch unter Kontrollbedingungen mit den MT assoziiert. In Neuronen kann nach HS eine Assoziation von HSP25 mit den MT gezeigt werden, die mittels indirekter Immunfluoreszenz nicht nachgewiesen werden konnte. Nach Stress zeigt sich, dass die HSPs, die in Astrozyten mit den MT assoziiert sind, auch in Neuronen MT-gebunden sind (s.

auch Tab. 5).

Ergebnisse 63 Tab. 5: Lokalisation von HSPs in Neuronen und Astrozyten

ausschließlich MT-gebunden

vorwiegend MT-gebunden

vorwiegend cytosolisch

cytosolisch + MT-gebunden Beide Zelltypen αB-Crystallin HSP25 HSP70

Neurone HSP32 HSP90

Astrozyten HSP32 HSP90

3.2.5 Reaktion von Neuronen und Astrozyten auf