Auf hydrophoben Oberflächen konnte neben der effizienten Induktion von Filamentbildung ebenfalls beobachtet werden, dass etwa 7% der Filamente eine Verdickung der Hyphenspitze zeigten (Abb. 12 A). Dies ging einher mit, verstärkter Färbung durch Calcofluor und Expression des AM1-Markers.
Kontaktwinkel [°]: 15±0,3 ´ 53,5±1 99,7±2 117±1,7 98,7±1
Glas Gelbond Parafilm Teflon Polypropylen 0
10 20 30 40 50
Filamentbildung [%]
A B
Kontaktwinkel [°]: 15±0,3 ´ 53,5±1 99,7±2 117±1,7 98,7±1
Glas Gelbond Parafilm Teflon Polypropylen 0
10 20 30 40 50
Filamentbildung [%]
Glas Gelbond Parafilm Teflon Polypropylen 0
10 20 30 40 50
Filamentbildung [%]
A B
_________________________________________________________________Ergebnisse
Ethanol
12-Hydroxystearinsäure 16-Hydroxypalmitinsäure Ethanol
12-Hydroxystearinsäure 16-Hydroxypalmitinsäure
Apressorienbildung[%]
5 20 15 10 30 25 35
A B
D
C
E
*
* *
* B
D
C
E
**
** **
**
Da beide bisher untersuchten Stimuli unabhängig voneinander Filamentbildung induzierten, wurde eine Kombination beider Stimuli benutzt und dabei die Expression des AM1-Markers in SG200AM1 untersucht. Hierbei zeigte sich, dass auf Parafilm in Anwesenheit von 12-Hydroxystearinsäure 27 % bzw. in Anwesenheit von 16-Hydroxypalmitinsäure 25 % aller Filamente eine terminale Verdickung bildeten und den AM1-Marker exprimierten (Abb. 12 A).
Abbildung 12. Die Appressorienbildung ist nach Inkubation auf einer hydrophoben Oberfläche in Anwesenheit von Hydroxy-Fettsäuren erhöht.
(A) Quantifikation der Appressorienbildung mit und ohne Hydroxy-Fettsäuren. SG200AM1 wurde in 2% YEPSL mit bzw. ohne Zugabe von 100 µM der angegebenen Hydroxy-Fettsäuren auf Parafilm aufgesprüht. Nach 20 h wurden die Zellen mit Calcofluor gefärbt und mikroskopisch untersucht. Dabei wurden die Filamente in einem Bildausschnitt gezählt und im selben Ausschnitt danach die Zahl der GFP exprimierenden Zellen, die ein Appressorium differenziert hatten, gezählt. Die Zahl der Appressorien wurde in drei unabhängigen Experimenten bestimmt, wobei jeweils mindestens 200 Filamente analysiert wurden. Die Fehlerbalken entsprechen dem Standardfehler.
(B-E) Repräsentative konfokalmikroskopische Aufnahmen von SG200AM1-RFP auf Parafilm in Anwesenheit von 16-Hydroxypalmitinsäure. Nach 20 h wurden die Zellen mit Calcofluor gefärbt (B), die Expression von zytoplasmatischem RFP (C) und der Expression der AM1- Markers (GFP) untersucht (D). (E) stellt eine Überlagerung der Kanäle aus (B), (C) und (D) dar. In dem dargestellten Ausschnitt sind Zellen in verschiedenen Stadien der pathogenen Differenzierung zu sehen: septierte Filamente sind durch offen Pfeile gekennzeichnet, Appressorien durch gefüllte Pfeile, der Stern kennzeichnet ein Filament, das aus einem Appressorium herauswächst, die Raute markiert ein sich entwickelndes Appressorium. Die Maßstabsbalken entsprechen 25 µm.
Um zu bestätigen, dass die Expression des AM1- Markers auf diejenigen terminalen Zellen beschränkt ist, die ein Appressorium differenzieren, wurden SG200AM1-RFP Zellen in Anwesenheit von 100 µM 16-Hydroxypalmitinsäure auf Parafilm gesprüht.
Dabei traten septierte Hyphen auf, bei denen nur die Spitzenzelle mit Zytoplasma
_________________________________________________________________Ergebnisse
A B
C D
gefüllt war und RFP exprimierte, während in den Spitzenzellen, die ein Appressorium differenzierte sowohl RFP als auch der AM1- Marker exprimiert wurden (Abb. 12 B-E).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kombination der beiden Stimuli Hydrophobizität und Hydroxy-Fettsäure eine effiziente Induktion von Appressorienbildung ermöglicht.
Auf hydrophile Oberfläche aufgebrachte SG200AM1-RFP Zellen, die mit Hydroxy-Fettsäuren behandelt wurden, bildeten lediglich unseptierte, vollständig mit Zytoplasma gefüllte Filamente (Abb. 13). Da der hydrophobe Stimulus bereits alleine zu einem geringen Prozentsatz Appressorienbildung induzierte, ist davon auszugehen, dass der hydrophobe Stimulus essentiell für die Appressorienbildung ist und die Hydroxy-Fettsäuren einen stimulierenden Effekt auf die Appressorienbildung auf hydrophoben Oberflächen haben.
Abbildung 13: Hydroxy-Fettsäuren sind nicht in der Lage Appressorienbildung auf einer hydrophilen Oberfläche zu induzieren.
SG200AM1-RFP wurde in 2% YEPSL in Anwesenheit von 100 µM 12-Hydroxystearinsäure auf einen Objektträger gesprüht. Nach 20 h Inkubation bei 28°C und 100% Luftfeuchte wurden die Zellen mit Calcofluor gefärbt und mittels Epifluoreszensmikroskopie untersucht.
Die filamentösen Zellen waren nicht septiert und vollständig mit Zytoplasma gefüllt. Eine repräsentative Zelle ist gezeigt. (A) DAPI Filter, (B) GFP Filter, (C) RFP Filter und (D) Überlagerung der Bilder aus (A), (B) und (C). Der Maßstabsbalken (20 µm) bezieht sich auf alle Bilder.
Um zu untersuchen, ob die Oberflächenwachse von Z. mays die Appressorienbildung von U. maydis induzieren können, wurde die Entwicklung von Appressorien in SG200AM1 auf Parafilm mit bzw. ohne Zugabe von einer Wachsemulsion mikroskopisch beobachtet. Dazu wurde zuerst das Oberflächenwachs von etwa 1000 7 Tage alten Maispflanzen gewonnen, mit Wasser gewaschen und mittels Ultraschallbehandlung zu einer Emulsion in Wasser weiterverarbeitet (siehe Material und Methoden). Dabei zeigte sich, dass die Zugabe von 20 ng/ml Wachs keinen Einfluss auf die Appressorienbildung hatte, während die Zugabe von 200 ng/ml einen statistisch signifikanten inhibierenden Effekt hatte (Abb.14).
_________________________________________________________________Ergebnisse
in vitro
10µm
0.5 1 1.5
2 2.5
3 3.5
in vitro Pflanzenoberfläche n=45 n=58
Appressoriumdurchmesser [µm]
Pflanzenoberfläche
10µm
A B
Abbildung 14: Die Appressorienbildung wird durch Zugabe von cuticulärem Wachs nicht beeinflusst.
SG200AM1 wurde in 2% YEPSL mit einer wässrigen Emulsion mit cuticulären Wachsen entsprechend der angegebenen Endkonzentrationen versetzt. Wasser diente als Kontrolle. Nach 20 h wurden die Zellen mit Calcofluor gefärbt und die Appressorienbildung, wie in der Legende zu Abbildung 12 beschrieben, quantifiziert. Bei einer Konzentration von 20 ng/ml Wachs war kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle festzustellen (p=0,55). Bei einer Wachskonzentration von 200 ng/ml eine wurde signifikante (*p=0,0016) Reduktion in der Appressorienbildung beobachtet.
Die in vitro induzierten Appressorien waren morphologisch nicht von den auf der Pflanze gebildeten Strukturen zu unterscheiden (Abb. 15 B). Es wurden mikroskopische Aufnahmen von 58 Appressorien unter in vitro Bedingungen und 45 Aufnahmen von Appressorien auf der Pflanzenoberfläche gemacht. Die in den Aufnahmen dargestellten Appressorien wurden mittels des Programms MetaMorph (siehe Material und Methoden) vermessen. Hierbei war im Mittel kein Größenunterschied feststellbar (Abb. 15 A), morphologische Unterschiede konnten ebenfalls nicht beobachtet werden (Abb. 15 B).
Abbildung 15: In vitro gebildete Appressorien und auf der Pflanzenoberfläche gebildete Appressorien haben den gleichen Durchmesser.
SG200AM1 wurde in 2% YEPSL in Anwesenheit von 100 µM 16-Hydroxypalmitinsäure auf Parafilm inkubiert oder in H2O resuspendiert und in 7 Tage alte Maissetzlinge injiziert. Nach 20 h wurden die Zellen mit Calcofluor gefärbt und mittels Epifluoreszensmikroskopie untersucht. Dabei wurden Aufnahmen von Appressorien gemacht, die den AM1-Marker exprimierten und anschließend mittels MetaMorph der Durchmesser bestimmt (A), wobei n der Zahl der analysierten Appressorien entspricht. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. (B) Beispiele von in vitro induzierten und auf der Blattoberfläche gebildeten Appressorien. Der Maßstabsbalken entspricht 10 µm.
0 1 2 3 4 5 6
Kontrolle 20 ng/ml 200 ng/ml
Appressorienbildung[%]
*
_________________________________________________________________Ergebnisse
A
C D
B
*
*
M
*
M
*
M
*
M
*
M
*
M
*
M
*
M
Um zu prüfen, ob es unter den beschriebenen in vitro Bedingungen zur Fusion kompatibler Sporidien kommt, wurden zwei kompatible haploide Stämme verwendet.
Der Stamm FB1 enthielt den AM1-Marker (FB1AM1) und der Stamm FB2 exprimierte konstitutiv RFP unter Kontrolle des otef Promoters (FB2RFP). Die Zellen beider Stämme wurden in 2% YEPSL gemischt und in Anwesenheit von 16-Hydroxypalmitinsäure auf Parafilm aufgesprüht. Nach 20 h hatten sich dikaryotische Filamente, sowie Appressorien gebildet. Dabei wurde die Expression des AM1-Markers wiederum nur in solchen Zellen beobachtet, die morphologisch erkennbar Appressorien ausgebildet hatten (Abb. 16).
Abbildung 16: Der AM1-Marker wird auch in dikaryotischen Filamenten, die ein Appressorium differenzieren, exprimiert.
FB1AM1 wurde mit FB2RFP gemischt und in Anwesenheit von 16-Hydroxypalmitinsäure, wie in der Legende zu Abb. 12. beschrieben, auf Parafilm gesprüht. Nach 20 h wurden die Zellen mit Calcofluor gefärbt und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. In (A) ist das Calcofluor Signal dargestellt, in (B) zytoplasmatische RFP Expression, in (C) die Expression des AM1- Markers und in (D) eine Überlagerung aller Kanäle. In dem dargestellten Bildausschnitt zeigen die Zellen verschieden Entwicklungsstadien: Paarung kompatibler Zellen ist mit (M) markiert, septierte Filamente sind durch offen Pfeile gekennzeichnet, Appressorien durch gefüllte Pfeile, der Stern kennzeichnet ein Filament, das aus einem Appressorium herauswächst, nachdem die Parafilm-Oberfläche nicht durchdrungen werden konnte.
_________________________________________________________________Ergebnisse