2.5. Inverse-electron-demand Diels-Alder reaction for MGE
2.5.4. Application of cyclopropene sugars with cooperation partners
So far, the sugars developed have been used to monitor glycosylation in cell lines by labeling the whole glycom (not-protein specific). In order to further elucidate the function of glycosylation, it would be very valuable to be able to monitor glycosylation of a specific protein. One approach that was previously described for azido-sugars is to combine the metabolic labeling of glycans with pull-down experiments for the protein of interest. Together with the LEGLER lab1 the series of cyclopropene modified sugars was used to investigate glycosylation of the chemokine receptor CCR7 [accepted manuscript: "Distinct CCR7 glycosylation pattern shapes receptor signaling and endocytosis to modulate chemotactic responses").[105] In cooperation with the ZUMBUSCH group2 Ac4GlcNCyoc is currently applied to investigate protein-specific labeling by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM)- Förster resonance energy transfer (FLIM-FRET). The details of these experiments can be found in “Visualization of Protein-Specific Glycosylation inside Living Cells” (Chapter 6.5)[106]
1 PhD thesis MARK HAUSER
2 PhD thesis FRANZISKA DOLL (ongoing)
3. Summary
“Sugars are everywhere. They are the foundation of all life on Earth.”[1]
In fact, their indispensability for energy delivery and structural support has been known for a long time. However, it was only during the past decades that the importance of glycans as modifiers of proteins and lipids and their inherent contribution to a myriad of cellular processes beyond energy delivery was recognized. To further elucidate their structures and functions, the development of a method to visualize glycans was desirable. Metabolic glycoengineering has been established as a highly valuable tool to investigate glycosylation and thus contributed significantly to carbohydrate research.[10-12] It allows the introduction of unnaturally modified carbohydrates into glycoconjugates, where they can be ligated to a probe for visualization or purification. This strategy relies on the application of bioorthogonal ligation reactions for example the azide alkyne cycloaddition (AAC)[13-14] or the inverse-electron- demand Diels-Alder (DAinv) reaction[15-18]. First MGE experiments exploited the reaction of a ketone with a hydrazide,[19] whereas nowadays azides are considered valuable chemical reporters. While many groups have focused on the application of the Staudinger ligation[20] or the AAC in its copper-catalyzed[21-23] or strain-promoted[24-25] version, our lab has recently introduced the DAinv reaction between a terminal alkene and a 1,2,4,5-tetrazine for metabolic glycoengineering (Chapter 6.1: “Two-Color Glycan Labeling of Live cells by a Combination of Diels-Alder and Click Chemistry”).[26] In addition to being an azide-independent reaction, the DAinv is irreversible,[27] does not need metal catalysis and can be performed under physiological conditions. Building on these findings, this dissertation focused on the further development of the DAinv reaction aiming to accelerate the reaction for its application in biological issues. First, several novel alkene-modified mannosamine derivatives were synthesized and tested for their suitability in MGE. It could be shown, that the cellular machinery also accepts carbamate groups as linkage between the sugar and the dienophile.
Thus, a whole series of mannosamine derivatives with terminal alkenes (attached via a carbamate) was synthesized and investigated concerning their suitability in MGE. It was confirmed, that with increasing chain length and thus increasing distance between the electron withdrawing carbamate group and the double bond, the reactivity in the DAinv was enhanced. However, the incorporation rate displayed an opposing trend; mannosamines with shorter chain lengths were better accepted by the cellular enzymatic machinery. Metabolic labeling experiments with a tetrazine-biotin derivative revealed that Ac4ManNBeoc has the optimal balance between reactivity and incorporation rate. However the reactivity was
3. Summary amendable, requiring high concentrations of tetrazine and a long incubation time (1 mM, 6 h) (Chapter 6.2: "Terminal Alkenes as Versatile Chemical Reporter Groups for Metabolic Oligosaccharide Engineering").[85]
To this end, sugars bearing faster reacting dienophiles were developed. Building on studies by SAUER et al,[84,86-87] we chose to exploit the ring strain of cyclic alkenes to accelerate the reaction. Norbornenes had previously successfully been used for the visualization of biomolecules in particular proteins. Two mannosamine-derivatives carrying a norbornene as reporter were synthesized. The derivatives differ in the stereochemistry of the attachment of the norbornene resulting in different reaction rates. In accordance with studies by KNALL[82] and CARELL[104], the exo-derivative reacts about 2.5 times faster than the endo-derivative and nearly 2 orders of magnitude higher than the average terminal alkene. The fast reaction rate compensates the poor incorporation of the bulky derivatives into glycoconjugates rendering the norbornene-modified sugars superior to the series of terminal alkenes, as the labeling conditions with tetrazine could be improved (1 mM, 6 h to 100 µM, 3 h) (Manuscript in preparation: “Exploring the Potential of Norbornene-Modified Mannosamine Derivatives for Metabolic Glycoengineering”).
Aiming for an even more efficient labeling, we focused on residues that would facilitate incorporation, meaning smaller reactive groups, while not forfeiting too much reactivity. A potential class of dienophiles meeting these criteria were cyclopropenes, whose potential was also recognized by the groups of DEVARAJ,[100,103] PRESCHER[72,99] and most recently YE.[102] We established a mannosamine derivative carrying a cyclopropene reporter with methyl-substitution of the cyclopropene double bond for stability reasons and a carbamate linkage for a high reactivity. This derivative, while being neglectably slower than the norbornene sugar (endo), led to an amazingly bright staining of cell-surface glycoconjugates. Its use allowed lowering the incubation time to 15 min with only 25 µM tetrazine. Furthermore, these optimized reaction conditions further enabled the usage of a tetrazine-dye conjugate, permitting one step labeling of the modified glycoconjugates. This novel derivative possesses the ideal qualifications for dual labeling of two differently modified sugars by combination of the DAinv reaction with the SPAAC. For example Ac4GlcNAz and Ac4ManNCyoc could successfully be labeled at the same time (Chapter 6.3: “Rapid Labeling of Metabolic Engineered Cell-Surface Glycoconjugates with a Carbamate-Linked Cyclopropene Reporter”).[45]
Encouraged by the accomplishments with the mannosamine derivative, the corresponding glucosamine and galactosamine derivatives were synthesized and explored for their potential to monitor intracellular glycosylation (Chapter 6.4: “Expanding the scope of cyclopropene reporters for the detection of metabolically engineered glycoproteins by Diels–Alder
3. Summary
reactions”).[101] In cooperation with the ZUMBUSCH group we combined MGE with Förster resonance energy transfer fluorescence lifetime microscopy which allowed us to monitor glycosylation of specific intracellular proteins (Chapter 6.5: “Visualization of Protein-Specific Glycosylation inside Living Cells”).[106]
Currently, several groups of the University of Konstanz apply the series of cyclopropene modified hexosamines (Ac4ManNCyoc, Ac4GlcNCyoc, and Ac4GalNCyoc) to investigate the glycosylation pattern of their proteins of interest. For example, the LEGLER group applied the sugars to monitor glycosylation of the chemokine receptor CCR7 (accepted manuscript:
"Distinct CCR7 glycosylation pattern shapes receptor signaling and endocytosis to modulate chemotactic responses").[105] In cooperation with Prof. SCHERER Azido-modified monosaccharides were used to investigate the recovery of the cupula (a membrane in the equilibrium organ) by monitoring the glycoprotein cupulin (Manuscript in preparation).
4. Zusammenfassung
“Sugars are everywhere. They are the foundation of all life on Earth.”[1] (Zucker sind überall.
Sie sind die Grundlage allen Lebens auf der Erde). Tatsächlich ist ihre Unabdingbarkeit als Energielieferanten und strukturgebende Komponenten schon seit langem bekannt. Dennoch wurde erst in den letzten Jahrzehnten ihre Bedeutung als Modifikatoren von Proteinen und Lipiden, und der damit verbundene Beitrag zu einer Vielzahl zellulärer Prozesse, auch über die Energielieferung hinaus, erkannt.
Um ihre Strukturen und Funktionen weiter aufzuklären, ist die Entwicklung von Methoden zur Visualisierung von Kohlenhydraten wünschenswert. Eine wirksame Methode zur Visualisierung wurde in den letzten zwei Jahrzenten entwickelt: das metabolische Glycoengineering (MGE).
[10-12] Es ermöglicht die Einführung unnatürlich modifizierter Monosaccharide in Glycokonjugate, wo sie mit einer Sonde zur Visualisierung oder Aufreinigung ligiert werden können. Diese Strategie beruht auf der Verwendung bioorthogonaler Ligationsreaktionen, zum Beispiel der Azid-Alkin-Cycloaddition (AAC)[13-14] oder der Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (DAinv-Reaktion)[15-18]. Erste MGE-Experimente nutzen die Reaktion eines Ketons mit einem Hydrazid;[19] heutzutage werden Azide als wertvolle chemische Reporter angesehen. Während sich viele Gruppen auf die Anwendung der Staudinger-Ligation[20] oder der AAC in ihrer kupferkatalysierten[21-23] oder ringspannungsvermittelten[24-25] Version konzentriert haben, hat unsere Gruppe vor kurzem die DAinv-Reaktion zwischen einem terminalen Alken und einem 1,2,4,5-Tetrazin für metabolisches Glycoengineering erfolgreich eingesetzt.[26] (Abschnitt 6.1: “Two-Color Glycan Labeling of Live cells by a Combination of Diels-Alder and Click Chemistry”).[26] Diese Azid-unabhängige Reaktion ist außerdem irreversibel,[27] kommt ohne Metallkatalyse aus und kann unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden.[28] Die Reaktivität der terminalen Alkene ließ jedoch noch Raum für Verbesserungen. Daher lag der Fokus dieser Dissertation auf der Entwicklung weiterer Dienophile als Reporter, um die Reaktion für die Beantwortung biologischer Fragestellungen zu beschleunigen. Zuerst wurde eine Serie Alken-modifizierter Mannosamin-Derivate synthetisiert und ihre Eignung für das MGE untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die zelluläre Enzymmaschinerie anstatt der natürlichen Amidbindung auch Carbamatverknüpfungen zwischen dem Zucker und dem Dienophil toleriert. Wir konnten zeigen, dass mit zunehmender Kettenlänge, einhergehend mit größerem Abstand zwischen dem elektronenziehenden Sauerstoff und der Doppelbindung, die Reaktivität in der DAinv-Reaktion erhöht wird. Die Einbaurate zeigte jedoch einen gegenläufigen Trend: Mannosamine
4. Zusammenfassung mit kürzerer Seitenkette wurden vom Stoffwechselweg der Zellen besser akzeptiert.
Metabolische Markierungsexperimente mit Tetrazin-Biotin zeigten, dass Ac4ManNBeoc die ideale Balance zwischen Reaktivität und Einbaurate besitzt. Mit einer Tetrazinkonzentration von 1 mM und einer Inkubationszeit von 6 Stunden war die Reaktivität jedoch noch verbesserungsfähig (Abschnitt 6.2: "Terminal Alkenes as Versatile Chemical Reporter Groups
for Metabolic Oligosaccharide Engineering").[85]
Daher wurden Zucker mit schneller reagierenden Dienophilen entwickelt. Aufbauend auf Studien von SAUER et al.[84,86-87] entschieden wir uns, die Ringspannung zyklischer Alkene zur Beschleunigung der Reaktion zu nutzen. Norbornene waren vorher erfolgreich für die Markierung von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen, verwendet worden. Für die Anwendung im MGE wurden zwei Mannosamin-Derivate mit einem Norbornen-Reporter synthetisiert. Diese Derivate unterschieden sich nur in der Stereochemie der Norbornenanknüpfung, die in unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten resultiert.
Übereinstimmend mit den Studien von KNALL[82] und CARELL[104] reagierte das exo-Derivat etwa 2,5 mal schneller als das endo-Derivat und fast 100-fach schneller als das durchschnittliche terminale Alken. Die schnelle Reaktionsrate gleicht die geringe Einbaurate der sperrigen Derivate aus, was die Norbornen-modifizierten Zucker den Zuckern mit terminalen Alkenen überlegen macht, da die Markierungsbedinungen mit dem Tetrazin verbessert werden konnten (von 1 mM, 6 h zu 100 µM, 3 h) (Manuskript in Vorbereitung: “Exploring the Potential of Norbornene-Modified Mannosamine Derivatives for Metabolic Glycoengineering”). Um das Ziel einer noch effizienteren Markierung zu erreichen, konzentrierten wir uns auf Reporter (kleinere reaktive Gruppen) welche den Einbau vereinfachen würden ohne zu viel Reaktivität einzubüßen. Eine vielversprechende Klasse von Dienophilen, die diesen Kriterien entspricht, sind Cyclopropene deren Potential auch von den Arbeitsgruppen DEVARAJ,[100,103]PRESCHER[72,99]
und kürzlich auch YE[102] erkannt wurde. Wir entwickelten ein Mannosamin-Derivat mit einem Cyclopropen-Reporter. Die Methyl-Substitution der Doppelbindung dient der Stabilität und die Carbamatverknüpfung einer höheren Reaktivität. Dieses nur vernachlässigbar langsamere Derivat – im Vergleich zum Norbornen-Derivat (endo)- führte zu einer besonders deutlichen Färbung der Glycokonjugate auf Zelloberflächen. Seine Verwendung erlaubte es, die Inkubationszeit auf 15 Minuten zu verkürzen, und das bei einer Tetrazinkonzentration von nur 25 µM. Des Weiteren ermöglichten diese optimierten Reaktionsbedingungen die Verwendung eines Tetrazin-Farbstoff-Konjugates und damit eine Einstufenmarkierung der modifizierten Glycokonjugate. Dieses neue Derivat besitzt die idealen Voraussetzungen um eine Zweifarbenmarkierung zweier verschiedener modifizierter Zucker durch eine Kombination der DAinv-Reaktion mit der ringspannungsvermittelten AAC durchzuführen. So konnten
4. Zusammenfassung
beispielsweise Ac4GlcNAz und Ac4ManNCyoc gleichzeitig markiert werden (Abschnitt 6.3:
“Rapid Labeling of Metabolic Engineered Cell-Surface Glycoconjugates with a Carbamate-Linked Cyclopropene Reporter”).[45]
Ermutigt durch die Erfolge des Mannosamin-Derivats, wurden die entsprechenden Glucosamin- und Galactosamin-Derivate synthetisiert und bezüglich ihres Potenzials zur Beobachtung intrazellulärer Glycosylierung validiert (Abschnitt 6.4: “Expanding the scope of cyclopropene reporters for the detection of metabolically engineered glycoproteins by Diels–
Alder reactions”).[101] In Kooperation mit der Arbeitsgruppe ZUMBUSCH konnten wir durch die Kombination von MGE und Förster-Resonanzenergietransfer-Fluoreszenzlebenszeit-Mikroskopie, die Visualisierung spezifischer, intrazellulärer EGFP-Fusionsproteinen erreichen (Abschnitt 6.5: “Visualization of Protein-Specific Glycosylation inside Living Cells”).[106]
Diese Serie von Cyclopropen-modifizierten Hexosaminen (Ac4ManNCyoc, Ac4GlcNCyoc, und Ac4GalNCyoc) wird zurzeit von mehreren Gruppen der Universität Konstanz verwendet, um ihre Zielproteine auf Glykosylierung zu untersuchen. Beispielsweise verwendet die Arbeitsgruppe LEGLER die Zucker, um die Glycosylierung des Chemokin-Rezeptors CCR7 zu untersuchen (Manuskript im Druck: "Distinct CCR7 glycosylation pattern shapes receptor signaling and endocytosis to modulate chemotactic responses").[105] In Kooperation mit Prof.
SCHERER wurden Azid-modifizierte Monosaccharide verwendet, um das Nachwachsen der Cupula (einer Membran des Gleichgewichtsorgans) über die Markierung des Glycoproteins Cupulin zu beobachten (Manuskript in Vorbereitung).
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