Apoptose und Expression der Apoptose relevanten Proteine BAX, BCL-2 und Caspase 8

In DU-145 und PC-3 Zellen wurde mit Hilfe der Immunzytochemie keine Apoptose nach Wachstumsfaktoren-Entzug nachgewiesen (nicht gezeigt). Zu den Initiatoren der Apoptose zählt p53, das posttranslational in der Reaktion auf Streß-Situationen, z.B.

Wachstumsfaktoren-Entzug modifiziert wird (Kishi et al., 2001, Prives and Manley, 2001, Dorman and Hupp, 2001). Die Prostatakarzinom-Zelllinie DU-145 hat Mutationen in beiden Allelen des p53 Gens und zeigt p53-ähnliche Proteine mit Molekulargewichten von 45 bzw. 50 kD. Eine Regulation der nachgeschalteten Proteine MDM2 und p21 war nicht sichtbar (Abb. 23, S. 69, Abb. 28, S. 77). Wie bereits die Ergebnisse von Honda et al.

(2002) zeigten, konnte in Western-Blot Analysen der vorliegenden Arbeit die Expression des proapoptotischen und durch p53 regulierten BAX nicht nachgewiesen werden. Die

Zellinie PC-3 exprimierte kein p53. Es ist daher denkbar, daß in DU-145 und PC-3 Zellen durch Wachstumsfaktoren-Entzug über den p53 Weg keine Apoptose ausgelöst wurde, da p53 als essentieller Sensor für Streß-Situationen und als Regulator der Apoptose nicht intakt ist oder fehlt. Daher ließ sich in den eigenen Untersuchungen die Aktivierung der p53-induzierten Apoptose durch die Streß-Situation des Wachstumsfaktoren-Entzugs offenbar nicht herstellen. Aus der Literatur ist allerdings bekannt, daß DU-145 und PC-3 Zellen in die Apoptose gehen können. So zeigten Experimente von Cattaneo-Pangrazzi et al. (2000), daß die Behandlung mit der zytotoxischen Substanz 5-dU-NOAC, einem Heterodinucleosid-Dimer, in beiden Zellinien Apoptose auslöste. Neben p53 können allerdings eine Reihe weiterer Signalproteine Apoptose in der Zelle auslösen, darunter die Membranproteine FAS/APO-1, Trail-R1 oder R2, TNF-R1 (Nagata et al., 1997), so daß die zytotoxische Substanz 5-dU-NOAC einen p53-unabhängigen Weg aktiviert haben könnte.

Dafür spricht, daß zytotoxische Substanzen die Expression von Fas-L induzieren können (Jones et al., 2001), der wiederum den membranständigen Rezeptor FAS/APO-1 aktiviert und auf diesem Weg Apoptose induziert (Nagata et al., 1997).

In LNCaP und MFM-223 Zellen waren nach Entzug von Wachstumsfaktoren und nach Behandlung mit den antiproliferativen Substanzen vermehrt apoptotische Zellen im TUNEL-Assay zu sehen (Abb. 33, S. 84 und 34, S. 87). LNCaP Zellen wiesen 7 % apoptotische Zellen nach Wachstumsfaktoren Entzug und 12 % apoptotische Zellen nach Zusatz des nicht steroidalen Antiandrogens CAS auf. Entsprechend dazu exprimierten LNCaP Zellen die Wildtyp-Variante von p53. Unter positiven Wachstumsbedingungen, wie 10 % FCS, waren entsprechend nur 1.5 % apototische Zellen enthalten, und nach Zusatz der proliferationsfördernden Substanzen DHT oder CPA betrug der Anteil apoptotischer Zellen 1.5 % bzw. 1 %. Der Entzug von Wachstumsfaktoren oder der Zusatz des Antiandrogens CAS in serumhaltiges Medium löste auch bei 4 % bzw. 8 % der MFM-223 Zellen Apoptose aus. Bei MFM-MFM-223 Zellen wurden ebenfalls nach Behandlung mit DHT, das bei diesen Zellen proliferationshemmend wirkte, 7 % apoptotische Zellen nachgewiesen. MFM-223 Zellen tragen zwar eine Punktmutation in Codon 132 (K132R) im p53 Gen, die aber auf die Regulation von MDM2 oder p21 durch p53 keinen Einfluß zu haben scheint (Abb. 26, S. 74, Abb. 31, S. 81). Somit ist die Funktion zur Regulation der nachgeschalteten Proteine (MDM2, p21) und der Apoptose gegeben. Wie bei LNCaP Zellen waren entsprechend weniger apoptotische MFM-223 Zellen unter positiven Wachstumsbedingungen nachzuweisen; z.B. in 10 % FCS mit 1 % apoptotischen Zellen oder nach Zusatz von CPA mit 2 % Apoptose.

Die Initiator-Caspase 8 ist ein Enzym mit Todes-Effektor Domäne (vergl. Abb. 4, S. 10). Mit dieser Domäne ist das Protein an die membranständigen Rezeptoren FAS/APO-1, Trail-R1 oder R2, TNF-R1 gebunden. Die Aktivierung der Caspase 8 erfolgt durch die Aktivierung des membrangebundenen Rezeptors oder auf anderen Wegen, die bisher nicht bekannt sind (Jones et al., 2001). Die Ergebnisse der eigenen Arbeit haben gezeigt, daß in serumreduzierten Medium, sowohl in LNCaP Prostatakarzinomzellen, als auch in MFM-223 Mammakarzinomzellen, die Expression von Caspase 8 durch den Entzug von Wachstumsfaktoren oder durch die Behandlung mit dem Antiandrogen CAS hochreguliert wurde (Abb. 39, S. 99). Zudem war in MFM-223 Zellen bei Anwesenheit von 10 % FCS und dem proliferationshemmenden DHT die Caspase 8 Menge erhöht. Der Anstieg des Caspase 8 Gehaltes war demnach mit der Wachstumshemmung der Zellen positiv korreliert. Unter regulären Wachstumsbedingungen (10 % FCS) mit niedriger Apoptoserate (1.5 %) war dagegen der Caspase 8 Gehalt in LNCaP und MFM-223 Zellen geringer als in Kulturen, deren Proliferation durch Wachstumsfaktoren-Entzug gehemmt waren (Tab. 8, S. 88, Abb. 39, S. 99 A). Auffällig war die vermehrte Expression von Caspase 8 in LNCaP Kulturen, die mit den proliferationsfördernden Substanzen DHT oder CPA behandelt wurden, gegenüber LNCaP Zellen, die in Wachstumsmedium mit 10 % FCS kultiviert wurden. Im Gegensatz dazu, war die Apoptoserate mit 1.5 % bei 10 % FCS und 1.5 % und 1 % nach Behandlung mit DHT oder CPA nahezu gleich. Hierbei muß darauf verwiesen werden, daß die Wirksubstanzen DHT und CPA einem Medium zugesetzt wurden, dem durch Aktivkohle-Filterung enthaltene Wachstumsfaktoren entzogen wurden. Daher könnte das Fehlen anderer essentieller Wachstumsfaktoren die Erhöhung von Caspase 8 erklären.

Zudem erreichten LNCaP Zellen nach Behandlung mit DHT oder CPA in 1 % Aktivkohle behandeltem Medium nicht die Gesamtzellzahl wie LNCaP Zellen, die in Wachstumsmedium (10 % FCS) kultiviert wurden (Abb. 10, S. 41).

Es sei darauf hingewiesen, daß die Morphologie von LNCaP und MFM-223 Zellen, die aus menschlichen Karzinomen stammten, fibroblastoid war, obwohl keine Begründung dafür anzugeben ist; die Morphologie hat sich im Verlauf der Untersuchungen unter verschiedenartigen Wachstumsbedingungen nicht verändert. Dies ist gut erkennbar am fibroblastoiden Typ der LNCaP Zellen (vergl. Abb. 6, S. 16; Abb. 12, S. 46; Abb. 33, S.

84). Die Morphologie beider fibroblastoiden Zellinien wurde besonders deutlich unter suboptimalen Wachstumsbedingungen, fotografiert im Phasenkontrast (vergl. Abb. 33, S.

84; Abb. 34, S. 87). Dagegen zeigten DU-145 und PC-3 Zellen eine beständige epitheloide Morphologie in der Kultur (Abb. 6, S. 16). LNCaP und MFM-223 Zellen erfuhren

Apoptose unter diesen Kultivationsbedingungen (vergl. Tab. 8, S. 88, Abb. 14, S. 51, Abb. 19, S. 61), ohne daß ein massives Absterben der Kulturen zu beobachten war.

Offenbar konnten die untersuchten Zellinien mehrere Tage ohne ausreichende Zufuhr von Nährstoffen unter vergleichbaren Bedingungen bei völligem Erhalt der Proliferationsfähigkeit überleben. Dies zeigt deutlich die Restimulierbarkeit des Wachstums von LNCaP Zellen nach Wachstumsarrest (Abb. 14, S. 51). Die in vitro Überlebensfähigkeit erscheint ein besonderer Vorteil bei der Arbeit mit Zellkulturen aus Tumoren zu sein.

In MFM-223 Zellen war die Anwesenheit von Caspase 8 konstitutiv höher als in LNCaP Zellen. In MFM-223 Zellen war auch unter regulären Wachstumsbedingungen in 10 % FCS eine höhere Expression des mit der Apoptose assoziierten Proteins nachzuweisen; bei Serum-Reduktion auf 1 % FCS wurde die Menge an Caspase 8 Protein etwa verdoppelt. Entsprechend war die Apoptose-Inzidenz in Wachstumsmedium (10 % FCS) mit 1 % geringer als nach Kultivierung in 1 % Aktivkohle behandeltem Medium mit 4 % apoptotischen Zellen. Dementsprechend war der Caspase 8 Gehalt nach Zusatz des wachstumsfördernden CPA in einer Konzentration von 10^-7 M geringer als in Kulturen, die in 1 % Aktivkohle behandeltem Medium ohne Wirkstoffzusatz wuchsen. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis waren in CPA-behandelten Kulturen nur 2 % apoptotische Zellen nachzuweisen, während die unbehandelte Kontrolle 4 % Apoptose aufwies. Nach Behandlung mit dem proliferationsfördernden CPA in 1 % Aktivkohle behandeltem FCS war wie in LNCaP Zellen eine Erhöhung des Caspase 8 Gehaltes gegenüber der Kultur in Wachstumsmedium (10 % FCS) zu sehen, obwohl die Apoptoseinzidenz mit 2 % und 1 % nahezu gleich groß war (Tab. 8, S. 88). Das Wachstum von MFM-223 Zellen erreichte allerdings nach Zusatz von 10^-7 M CPA in 1 % Aktivkohle behandeltem Medium nicht die Zellzahl, wie Kulturen, die in Wachstumsmedium (10 % FCS) gehalten wurden (vergl. Abb. 19 C mit Abb. 19 D, S. 61). Demnach könnte, wie bei LNCaP Zellen, das Fehlen anderer essentieller Wachstumsfaktoren die Erhöhung von Caspase 8 in diesen MFM-223 Kulturen erklären. Die stärkste Expression von Caspase 8 war in MFM-223 Zellen nach Behandlung mit 10^-8 M DHT zu sehen. Interessanterweise übertraf dies den Gehalt von Caspase 8 nach Behandlung von MFM-223 Zellen mit 10^-7 M CAS, obwohl die Inzidenz der Apoptose unter diesen Bedingungen mit 7 % bzw. 8 % vergleichbar war (Tab. 8, S. 88, Abb. 39, S. 99). Eine Erklärung hierfür wäre, daß je nach Substanz DHT oder CAS unterschiedliche Signalkaskaden wirksam werden und die Apoptose nach Behandlung mit CAS vermehrt über den mitochondrialen Weg eingeleitet

wird. In LNCaP und MFM-223 Zellen war der Apoptose induzierende Effekt des Anti-androgens CAS sehr groß. Bei MFM-223 Zellen konnte gezeigt werden, daß in 10 % FCS der Zusatz von 10^-7 M CAS das Wachstum auf 77 % reduzierte. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation dieser Zellen nach Zusatz von 10^-8 M DHT auf 42 % verringert, der Anteil apoptotischer Zellen war jedoch vergleichbar (Tab. 8, S. 88). Diese Ergebnisse könnten dafür sprechen, daß durch die Behandlung mit dem Antiandrogen CAS in MFM-223 Zellen in erster Linie Apoptose ausgelöst wird, während die höhere Wachstumshemmung nach Zugabe der geringeren Menge von DHT bei vergleichbarer Apoptoseinzidenz daraufhin deutet, daß neben der Apoptose ein G1-Arrest induziert wurde.

Die Analyse des proapoptotischen BAX in den Zellinien LNCaP und MFM-223 ergab regelhaft eine deutliche Korrelation zur Inzidenz der apoptotischen Zellen. Mit zunehmender Anzahl apoptotischer Zellen war auch der Gehalt von BAX Protein in beiden Zellinien erhöht (Abb. 35, S. 90, Abb. 36, S. 93).

Die Menge an antiapoptotischem BCL-2 war bei LNCaP Zellen unter optimalen Wachstumsbedingungen ungefähr um die Hälfte geringer als in Kulturen, die in Aktivkohle behandeltem Serum und nach Zusatz von DHT, CPA oder CAS kultiviert wurden. Der Gehalt von BCL-2 war nach Entzug von Wachstumsfaktoren oder nach Zusatz von DHT, CPA oder CAS nahezu gleich (Abb. 37, S. 95, Abb. 38 A, S. 97). Wie schon erwähnt wurde, sind die Wirksubstanzen DHT und CPA einem Medium zugesetzt worden, dem durch Aktivkohle-Filterung enthaltene Wachstumsfaktoren entzogen wurden. Daher könnte das Fehlen anderer essentieller Wachstumsfaktoren die Erhöhung von BCL-2 erklären.

Zudem erreichten LNCaP Zellen nach Behandlung mit DHT oder CPA in 1 % Aktivkohle behandeltem Medium nicht die Gesamtzellzahl wie LNCaP Zellen, die in Wachstums-medium (10 % FCS) kultiviert wurden (Abb. 10, S. 41). Aus der Literatur ist bekannt, daß LNCaP Zellen nach Hormon-Ablation vermehrt BCL-2 exprimieren (Catz et al., 2001).

Eine verstärkte Expression des antiapoptotischen BCL-2 wurde auch nach radioaktiver Bestrahlung oder Chemotherapie beobachtet (Chaudhary et al., 1999, Huang et al., 1998;

Catz). Es wird vermutet, daß diese Hochregulation von BCL-2 nach wachstumshemmender oder zytotoxischer Behandlung eine Adaption der Zellen ist, um den programmierten Zelltod zu entgehen. Der BCL-2 Gehalt erfuhr bei MFM-223 Zellen ebenfalls keine Änderungen in Abhängigkeit von der Behandlung (Abb. 38 B, S. 97). Der Gehalt des Proteins war in diesen Zellen konstitutiv höher als in LNCaP Zellen. In der Literatur sind bisher keine Untersuchungen über die Expression von BCL-2 in MFM-223 Zellen beschrieben.