Anzahl an PECPL-Plasmiden pro COS-7 Zelle zu verschiedenen Zeitpunkten nach

HD-Standardprotokoll

Für die Quantifizierung von PECPL-Plasmiden pro COS-7 Zelle wurden COS-7 Zellen zunächst mit dem FuGENE^® HD-Standardprotokoll der PECPL-Methode transfiziert.

Dazu wurden jeweils 10 ng/µl PECPL und HLA-A2-pHSE Plasmid-DNA mit FuGENE^® HD Reagenz versetzt und zu den COS-7 Zellen hinzugegeben. Als Transfektionskontrolle wurden COS-7 Zellen in einem Parallelansatz mit 10 ng/µl pcDNA-sGFP transfiziert und grüne Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Zu definierten Zeitpunkten (0, 2, 4, 6, 24, 48, 72 h) nach der Transfektion wurden jeweils 5 x 10⁵ Zellen geerntet und ihre DNA extrahiert. Die Zellen wurden zuvor viermal mit 1 x PBS gewaschen, um Plasmide zu entfernen, die unspezifisch an die Zelle gebunden haben. qPCR erfolgten jeweils in Triplikaten mit DNA, die 1 x 10³ Zellen repräsentiert. Die Anzahl der PECPL-Plasmide pro COS-7 Zelle wurde bestimmt, indem die erhaltenen Ct-Werte in Relation zu denen der mitgeführten Standards gesetzt wurden. In Abbildung 17 wurde die Anzahl an PECPL-Plasmiden pro COS-7 Zelle zum jeweiligen Zeitpunkt aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt.

Innerhalb der ersten sechs Stunden nach der Transfektion nimmt die Anzahl an PECPL-Plasmiden pro Zelle ausgehend von ≈ 430 zum Zeitpunkt 0 h, über ≈ 12.000 nach 2 h auf ≈ 30.000 nach 6 h zu. Im Zeitraum von 6 bis 72 h nach Transfektion hingegen bleibt die Anzahl an PECPL-Plasmiden pro Zelle relativ konstant (24 h: ≈ 28.000;

48 h: ≈ 27.000 und 72 h: ≈ 34.000). COS-7 Zellen, die mit pcDNA-sGFP transfiziert wurden, exprimierten in allen drei unabhängigen Versuchen gleichermaßen sGFP.

Abbildung 17: Anzahl an PECPL-Plasmiden pro COS-7 Zelle zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion mit dem FuGENE^® HD-Standardprotokoll.

Die Quantifizierung der PECPL-Plasmide pro COS-7 Zelle erfolgte durch qPCR. Die dabei erhaltenen Ct-Werte aus drei unabhängigen Experimenten wurden in Relation zu den mitgeführten Standardkurven gesetzt (Steigungen: -3,55 ± 0,07, R² = 0,995 ± 0,005). Die Mittelwerte der Anzahl an PECPL-Plasmiden pro Zelle wurden zu den Zeitpunkten 0, 2, 4, 6, 24, 48 und 72 h nach der Transfektion mit jeweils 10 ng/µl PECPL und HLA-A2-pHSE Plasmid-DNA angegeben. Die Effizienz der qPCR beträgt 0,92 ± 0,03. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Mittelwerte dar.

3.4.2.2 Anzahl an PECPL-Plasmiden pro COS-7 Zelle nach FuGENE^® HD Transfektionen mit verschiedenen PECPL-Konzentrationen

Üblicherweise werden die COS-7 Zellen in einem Aktivierungsversuch 48 und 72 h nach der Transfektion mit einer Kapillare isoliert. Um die Anzahl der PECPL-Plasmide pro Zelle zu diesen Zeitpunkten zu reduzieren, wurden die Bedingungen des Standard-protokolls der FuGENE^® HD Transfektion bezüglich der PECPL-Konzentration modi-fiziert. COS-7 Zellen wurden deshalb mit vier verschiedenen PECPL-Konzentrationen (3,3 ng/µl, 1,0 ng/µl, 0,33 ng/µl sowie 0,10 ng/µl) transfiziert. Für den direkten Vergleich wurden COS-7 Zellen in einem Parallelansatz gemäß Standardprotokoll transfiziert (10 ng/µl). Die eingesetzte Konzentration an HLA-A2-pHSE hingegen blieb mit 10 ng/µl bei allen fünf Transfektionsansätzen konstant. Für die Abschätzung der Transfektionseffizienz wurden COS-7 Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an pcDNA-sGFP transfiziert. Als Negativkontrollen wurden COS-7 Zellen zudem mit Ansätzen versetzt, die die fünf verschiedenen Plasmid-DNA Konzentrationen, jedoch nicht das FuGENE^® HD Transfektionsreagenz enthielten.

Zu den Zeitpunkten 48 h und 72 h nach der Transfektion wurden jeweils 5 x 10⁵ COS-7 Zellen nach viermaligem Waschen mit 1 x PBS geerntet und ihre DNA extrahiert. Die

0 1×10⁴ 2×10⁴ 3×10⁴ 4_×10⁴ 5_×10⁴

2 4 6 24 48 72

h

PECPL-Plasmide pro Zelle

Quantifizierung der PECPL-Plasmide pro Zelle erfolgte mittels qPCR wie in 3.4.2.1 beschrieben.

Die Anzahl der PECPL-Plasmide pro Zelle zu den jeweiligen Zeitpunkten nach der Transfektion mit fünf verschiedenen PECPL-Konzentrationen wurde in Abbildung 18 dargestellt. Sie zeigt die gemittelten Werte aus drei unabhängigen Versuchen.

Abbildung 18: Anzahl an PECPL-Plasmiden pro COS-7 Zelle 48 h und 72 h nach FuGENE^® HD Transfektionen mit verschiedenen PECPL-Konzentrationen.

Die Zellen wurden hierfür gemäß dem Standardprotokoll mit 10 ng/µl PECPL sowie mit 3,3; 1,0;

0,33 und 0,10 ng/µl PECPL transfiziert. Die Quantifizierung der PECPL-Plasmide erfolgte durch qPCR in drei unabhängigen Experimenten. Die dabei erhaltenen Ct-Werte der zu analysierenden Proben wurden in Relation zu den mitgeführten Standardkurven gesetzt (Steigungen: -3,55 ± 0,05; R² = 0,998 ± 0,001).

Die gemittelte Anzahl der PECPL-Plasmide pro Zelle wurde für die Zeitpunkte 48 h (grau) und 72 h (schwarz) nach der Transfektion angegeben. Die Effizienz der drei qPCR beträgt 0,91 ± 0,02.

Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Triplikate dar.

Je weniger DNA transfiziert wird, desto niedriger ist die Anzahl an PECPL-Plasmiden pro Zelle zu den jeweiligen Zeitpunkten. Die Anzahl an PECPL-PECPL-Plasmiden pro Zelle der beiden Zeitpunkte 48 und 72 h unterscheidet sich dabei, wie erwartet, nur wenig (Abbildung 17). Durch die Transfektion von 0,10 ng/µl bis 10 ng/µl können einzelne COS-7 Zellen generiert werden, die PECPL-Plasmide im Bereich von

≈ 3.000 bis 24.000 aufweisen. Werden 0,33 ng/µl, 1,0 ng/µl bzw. 3,3 ng/µl PECPL transfiziert, so enthält eine Zelle nach 48/72 h ≈ 4.000, ≈ 6.500 bzw. ≈ 17.000 PECPL-Plasmide.

Um auszuschließen, dass die verminderte Anzahl der PECPL-Plasmide pro Zelle bei

zurückzuführen ist, erfolgte ein Kontrollversuch, bei dem zwei verschiedene Ansätze parallel transfiziert wurden: Der eine Ansatz enthielt 0,10 ng/µl PECPL-DNA, während der zweite zusätzlich mit 9,9 ng/µl Träger-DNA aus Heringsperma versetzt wurde. Die Konzentration an Träger-DNA entspricht der Differenz der eingesetzten Konzentration an PECPL-DNA im Vergleich zum Standardprotokoll. qPCR erfolgten mit DNA von 1 x 10³ transfizierten Zellen, die zu den Zeitpunkten 0, 2, 4, 6, 24, 48 und 72 h geerntet wurden. Bei der Quantifizierung konnten keine signifikanten Unterschiede detektiert werden. Artefakte durch Adsorption der Plasmide können daher ausgeschlossen werden.

Die mitgeführten Negativkontrollen zeigen, dass die Anzahl der PECPL-Plasmide, die unspezifisch an die Zellmembran von COS-7 Zellen gebundenen haben, vernachlässig-bar ist. Nach 48/72 h wurden lediglich bei den drei höchsten Konzentrationen an Plasmid-DNA durchschnittlich 5/2 (10 ng/µl), 2/1 (3,3 ng/µl) und 1/0 (1,0 ng/µl) PECPL-Plasmide pro Zelle nachgewiesen. Demzufolge werden durch das viermalige Waschen mit PBS unspezifisch gebundene PECPL-Plasmide nahezu vollständig entfernt.

COS-7 Zellen, die parallel mit unterschiedlichen Konzentrationen an pcDNA-sGFP transfiziert wurden, exprimieren in allen drei unabhängigen Versuchen gleichermaßen sGFP. Mit abnehmender Konzentration an Plasmid-DNA sinkt der Anteil sGFP expri-mierender Zellen.

3.4.2.3 Anzahl an PECPL-Plasmiden pro COS-7 Zelle zu verschiedenen