Antioxidative Aktivität des Quillaja-Saponin-Extrakts

An-teil des unpolaren Eluenten der über die Umkehrphasensäule läuft und damit die Sub-stanzen je nach Polarität trennt. Somit wird durch die Aufreinigung des Quillaja-Saponin-Extrakts nicht nur die Konzentration an hydrophoberen Saponinen, sondern auch die der hydrophoberen phenolischen Bestandteile erhöht.

bezogen (s. Abbildung 8). Mittels des DPPH-Tests lässt sich die maximal zu erreichen-de Inhibition und die Konzentration, bei erreichen-der 50% erreichen-der ursprünglichen DPPH-Konzentration durch ein Antioxidans reduziert worden ist (IC50), ermitteln.

Abbildung 8: DPPH-Inhibition in Anwesenheit des nativen (QSE) und aufgereinigten (QSF) Quillaja-Saponin-Extrakts in destilliertem Wasser sowie von α-Tocopherol in Methanol in Abhängigkeit der Konzentration der pheno-lischen Bestandteile oder der α-Tocopherol-Konzentration

Sowohl der native als auch aufgereinigte Quillaja-Saponin-Extrakt zeigten eine kon-zentrationsabhängige Reduzierung des DPPH (Abbildung 8). Allerdings unterschieden sich die beiden Proben signifikant im IC50, d.h. die antioxidative Aktivität des nativen Extraktes (IC50=8,1 µg Seq/mL) war mehr als doppelt so hoch wie die des aufgereinig-ten Extraktes (IC50=18,2 µg Seq/ml). Der höhere Anstieg der Regressionsgeraden des nativen Extrakts weist darüber hinaus auf eine effektivere antioxidative Kapazität im Vergleich zum aufgereinigten Extrakt hin. Somit besitzt der native Extrakt nicht nur den höheren Gehalt an Antioxidantien, sondern zeigt auch eine geeignetere Zusammenset-zung der Antioxidantien, die eine höhere Reaktivität gegenüber dem DPPH-Radikal aufweisen.

Die antioxidative Aktivität des aufgereinigten Extrakts ist mit der von α-Tocopherol aufgrund des ähnlichen IC50 von 16,5 µg/ml vergleichbar. Der native Extrakt weist hin-gegen eine deutlich höhere Reaktivität auf. Da sowohl die in den Extrakten nachgewie-senen Phenolsäuren als auch α-Tocopherol nur eine Hydroxylgruppe in ortho-Stellung besitzen, welche für die radikalfangenden Eigenschaften verantwortlich sind, ist die Reaktionsstöchiometrie gleich. Das Reaktionsvermögen der Antioxidantien wird

dar-0,00 0,05 0,10 0,15

0 20 40 60 80 100

DPPH-Inhibition [%]

Phenol- und a-Tocopherol-Konzentration [mg Seq/ml//mg/ml]

QSE QSF

a-Tocopherol

über hinaus durch die weiteren Substituenten und deren sterische Eigenschaften beein-flusst (Lucarini & Pedulli, 2010). Der niedrigere IC50 zeigt daher, dass die Substituenten der Phenole im nativen Extrakt die Wasserstoffabgabe begünstigen.

Dennoch wurde die maximale DPPH-Inhibition für α-Tocopherol bei deutlich niedrige-ren Konzentrationen als beim nativen Extrakt erreicht. Dies kann durch die unterschied-lichen Lösungsmittel erklärt werden. So wurde aus Gründen der Löslichkeit für α-Tocopherol und DPPH Methanol und für die Extrakte destilliertes Wasser verwendet. In polaren Lösungsmitteln kann es zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken kommen, die eine Annäherung von Radikalen und der Hydroxylgruppe der Antioxidantien erschwe-ren (Foti, 2015).

Elektronenspinresonanzspektroskopie zur Bewertung der antioxidativen Kapazität von Quillaja-Saponin-Extrakt stabilisierten dispersen Systemen

Mittels ESR-Spektroskopie ist es nun möglich, die antioxidativen Eigenschaften in Ab-hängigkeit der polaren bzw. unpolaren Phase zu quantifizieren und somit die Lokalisie-rung der Antioxidantien des Quillaja-Saponin-Extrakts abzuschätzen.

Zur Untersuchung der antioxidativen Aktivität in der hydrophoben Phase wurde das hydrophobe Galvinoxyl-Radikal in Ethanol gelöst (2 mmol/l) und anschließend wurden davon 10 µl in 990 µl der wässrigen mizellaren Quillaja-Saponinlösungen (0,16-1,0 % TS) überführt. Als Antioxidantien-freie Referenz diente eine mizellare Tween^® 80 Lö-sung (1 % TS). Im ESR-Spektrum zeigte sich ähnlich wie bei mizellaren SDS-, Brij- und CTAB-Lösungen (Heins, McPhail, et al., 2007) für Tween^® 80 die typische Hyper-feinstruktur des Galvinoxyl-Radikals (s. Abbildung 9a).

Abbildung 9: Spektren des Galvinoxyl-Radikals (0,02 mmol/l), welche zunächst in Ethanol gelöst und dann in mi-zellare Tween^® 80-Lösungen (a) und mizellare Lösungen des nativen Quillaja-Saponin-Extrakts (b) überführt wurden

Diese ist auf die Wechselwirkung des ungepaarten Elektron-Spins mit den Kernspins der Protonen des Zentral-Kohlenstoffs und den vier äquivalenten Protonen am aromati-schen Ring zurückzuführen (Weil & Bolton, 2007). Allerdings konnte dies in

Quillaja-10 G a)

10 G b)

wesenheit von Sauerstoff in den Mizellen, der mit den Protonen des aromatischen Rings des Galvinoxyl wechselwirkt und dadurch die Ausbildung der Hyperfeinstruktur ver-hindert. Dennoch ist davon auszugehen, dass die gesamte Menge an Galvinoxyl in den Quillaja-Saponinlösungen mizelliert vorliegt. So entsprachen die Peakflächen der ESR-Spektren von 0,02 mmol/l Galvinoxyl in Quillaja-Saponinlösungen denen der Tween^® 80-Lösungen.

Da aufgrund der bereits im Quillaja-Saponin-Extrakt enthaltenen phenolischen Bestand-teile keine Negativkontrolle durchgeführt werden konnte, d.h. die Mizellierung des Gal-vinoxyl in Saponinmizellen in Abwesenheit von Phenolen, wird die antioxidative Akti-vität gegenüber Galvinoxyl durch das Zusammenspiel von Saponinen und Phenolen beeinflusst.

Abbildung 10: Abbau des Galvinoxyl-Radikals in Abhängigkeit der Konzentration an phenolischen Bestandteilen im nativen (QSE) und aufgereinigten (QSF) Quillaja-Saponin-Extrakt und dem jeweiligen asymptotischen exponentiel-len Fit

Sowohl durch den nativen als auch aufgereinigten Extrakt wird die Menge an Galvi-noxyl-Radikalen reduziert. Im Gegensatz zu den synthetischen Emulgatoren CTAB, Brij und SDS konnte hier allerdings mit zunehmender Konzentration kein linearer Zu-sammenhang beobachtet werden (Heins, McPhail, et al., 2007). Zur mathematischen Beschreibung des konzentrationsabhängigen Verhaltens der Galvinoxyl-Reduktion konnte ein asymptotischer exponentieller Fit angelegt werden (s. Abbildung 10). Das nicht-lineare Verhalten deutet darauf hin, dass die Antioxidantien mit den Saponinmo-lekülen an der Grenzfläche wechselwirken. Dabei könnte es sich um Zucker-Zucker-Wechselwirkungen handeln, die bereits für die Wechselwirkung zwischen

Saponinmo-0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12

0,002 0,004 0,006

0,008 QSE

QSF

Konzentration Galvinoxyl-Radikal[mg/ml]

Phenolkonzentration [mg Seq/ml]

lekülen beschrieben wurden (Golemanov et al., 2012) und ebenso zwischen den Zu-ckergruppen der Saponinmoleküle und phenolischen Glykosiden bestehen können. Eine Erhöhung der Quillaja-Saponinkonzentration führt zunächst zu einem Wachstum der bereits vorhandenen Mizellen. Die Anlagerung neuer Saponinmoleküle bewirkt die Ak-kumulierung von Phenolen an der Grenzfläche, wodurch es zu einer weiteren Reduktion des Galvinoxyl kommt. Das Wachstum der Mizellen ist allerdings durch die optimale Oberflächenkrümmung limitiert (s. Artikel I), so dass neue Mizellen gebildet werden, die kein weiteres Galvinoxyl enthalten und somit auch keinen Effekt auf die Reduzie-rung des Radikals haben. Aus diesem Grund hat eine weitere Erhöhung der Quillaja-Saponinkonzentration zunehmend geringeren Einfluss auf die Galvinoxyl-Reduktion.

Gegenüber dem hydrophoben Galvinoxyl lässt sich eine deutlich höhere antioxidative Aktivität für den aufgereinigten Quillaja-Saponin-Extrakt im Vergleich zum nativen feststellen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass sich die Menge an Antioxi-dantien nahe der Grenzfläche durch die Aufreinigung erhöht hat. Die erhöhte Hydro-phobizität der adsorbierten Saponine und Phenole kann eine Annäherung der Antioxi-dantien an die Radikale und somit eine effizientere Radikal-Reduzierung ermöglichen.

Dieses wird durch die Studie von Heins et al. (2007) bestätigt, welche diesen Effekt in nicht-ionischen Mizellen anhand der Reaktionskinetik von Galvinoxyl gegenüber Galla-testern mit zunehmender Alkylkettenlänge beobachteten.

Abbildung 11: Abbau des Fremy’s Radikal in Abhängigkeit der Konzentration an phenolischen Bestandteilen im nativen (QSE) und aufgereinigten (QSF) Quillaja-Saponin-Extrakt und dem jeweiligen linearen Fit

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

0,0 0,1 0,2

0,3 QSE

QSF

Konzentration Fremy's Radikal [mg/ml]

Phenolkonzentration [mg Seq/ml]

Die Aktivität von Antioxidantien gegenüber dem in der hydrophilen Phase gelösten Fremy’s Radikal zeigte im Gegensatz zur Galvinoxyl-Reduktion ein konzentrationsun-abhängiges Verhalten (s. Abbildung 11). Dieses weist darauf hin, dass die Antioxidan-tien in der wässrigen Phase ungehindert mit den Radikalen interagieren können und die Konzentration an Antioxidantien mit zunehmender Quillaja-Saponinkonzentration steigt. Anhand der Anstiege der linearen Regressionsgeraden (s. Abbildung 11) lässt sich eine 1,6-fach höhere antioxidative Aktivität für den nativen Quillaja-Saponin-Extrakt im Vergleich zum aufgereinigten Quillaja-Saponin-Extrakt beobachten. Dieses basiert zum einen auf der mittels HPLC nachgewiesenen höheren Konzentration an hydrophilen Antioxi-dantien im nativen Extrakt. Zum anderen bestätigt dies, warum die Aktivität der Antio-xidantien des nativen und aufgereinigten Quillaja-Saponin-Extrakts gegenüber dem Galvinoxyl-Radikal umgekehrt ausgeprägt ist. Denkbar ist, dass die Antioxidantien des aufgereinigten Quillaja-Saponin-Extrakts tiefer in der Grenzflächenschicht lokalisiert sind und mehr Wechselwirkungen mit den Saponinen eingehen können. Dieses könnte wiederum zu einer verringerten Diffusion der Antioxidantien in die wässrige Phase füh-ren, so dass die antioxidative Aktivität gegenüber dem Fremy`s Radikal reduziert ist.

Ähnlich wird dieses für einen nicht-ionischen Emulgator mit steigender Hydrophobizi-tät der Antioxidantien gezeigt (Heins, McPhail, et al., 2007).

Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass der antioxidative Effekt des Quillaja-Saponin-Extrakts durch dessen phenolische Bestandteile dominiert wird. Besonders deutlich wird die Rolle der Polarität der Grenzfläche sowie der Antioxidantien auf die antioxidative Kapazität, da sich eine Veränderung der Zusammensetzung des Extrakts konträr auf die Aktivität in der hydrophilen bzw. hydrophoben Phase auswirkt.

3.3.3 Lipidoxidation in Quillaja-Saponin-Extrakt stabilisierten O/W-Emulsionen