Anreicherung der Tumorzellen über Dichtegradienten-Zentrifugation

Für „Spiking-Versuche“ mit dem OncoQuick-Gradienten wurde die Zelllinie G112 verwendet. Mit diesem Verfahren ließ sich jedoch nur ein geringer Anteil der in 15 ml Vollblut verdünnten Zellen wiederfinden. Die Zellsuspension, die nach Aufbereitung über den OncoQuick-Gradienten gewonnen wurde und MNC wie G112-Zellen enthielt, war sehr zellarm. Dies wäre insofern von Vorteil, dass nur eine geringe Zellzahl bzw.

Anzahl an Objektträgern pro Patient untersucht werden müsste. Die Zytospins der gewonnenen Zellsuspension wurden mit Immunfluoreszenzfärbungen auf die Häufigkeit von GFAP- bzw. EMMPRIN-positiven Zellen untersucht. Es wurde jedoch lediglich eine maximale Wiederfindungsrate von ca. 10% erzielt (1.464 Zellen von

ursprünglich 15.000 eingesetzten G112-Zellen). Diese geringe Wiederfindungsrate lässt sich zu einem Anteil damit erklären, dass die Zellsuspensionen nach der Zentrifugation eine hohe Anzahl an Thrombozyten enthielten. Dies verminderte die Haftung der Zellen an den Objektträgern und hatte einen flächenhaften Verlust von Zellmaterial während der Färbungen zur Folge. Deshalb wurde diese Methode nicht zur Aufbereitung von Patientenblut verwendet.

3.1.2.2. Boyant-Gradient

Für die Bestimmung von Wiederfindungsraten von zirkulierenden Gliomzellen mit dem Boyant-Gradienten wurde die Zelllinie U373 eingesetzt. Da nicht bekannt war, in welchem Bereich des Gradienten sich Tumorzellen glialen Ursprungs anreichern lassen würden, wurde bis auf das Erythrozytensediment der gesamte Gradient in einzelnen Fraktionen untersucht. Zytospins der einzelnen Fraktionen wurden immunzytochemisch mit anti-GFAP (Dako) und alkalischer Phosphatase gefärbt (Versuch A). Alternativ wurden die Zellen vor Einbringen in das Probanden-Blut mit CellTracker™ markiert, und anschließend wurden die einzelnen Fraktionen mit dem Fluoreszenzmikroskop untersucht (Versuch B). Bei beiden Versuchsanordnungen (A und B) zeigte sich eine Verteilung der U373-Zellen auf viele Fraktionen. Lediglich die obersten 3 ml klaren Überstandes waren frei von U373-Zellen. In einem weiteren Versuch wurden dann U373-Zellen in DMEM Medium anstatt in Vollbut verdünnt (Versuch C). Hierbei konnte die Bestimmung der Zellzahl nach Aufarbeiten mit dem Gradienten in einer Neubauer Zählkammer erfolgen, da die gewonnene Zellsuspension ausschließlich U373-Zellen enthielt. Es wurden 84% der Zellen im Bereich der Grenze zwischen Medium- und Gradienten-Flüssigkeit gefunden. Eine solche scharfe Trennung der U373-Zellen von den Blutbestandteilen ließ sich aber nicht erzielen. Wie in Abbildung 12 ersichtlich zeigte sich in den Versuchsanordnungen A und B vielmehr eine relativ homogene Verteilung der eingesetzten U373-Zellen über den Gradienten. Es wird angenommen, dass das Dichteverhältnis des Gradienten für den Versuch, Tumorzellen glialen Ursprungs aus Blut zu isolieren, ungünstig ist. Weiterhin kam es auch bei diesem Gradienten zu flächigen Zellverlusten bei der Färbung der Zytospins. Dies wurde wie beim OncoQuick-Gradienten auf die hohe Anzahl von Thrombozyten in den angereicherten Zellfraktionen zurückgeführt. Es war ebenfalls ungünstig, dass die

Fraktionen, die eine hohe Anreicherung von U373-Zellen erbrachten, gleichzeitig sehr zellreiche Fraktionen waren. Dies würde die Untersuchung großer Zellzahlen und damit Objektträgern erfordern, obwohl nur ein Volumen von 5 ml Blut eingesetzt würde. Im Versuch A bedeutet dies eine Untersuchung von ca. 10⁷ Zellen, um eine Wiederfindungsrate von 27% (14% + 13%) in den beiden mittleren Fraktionen zu erzielen. Aus den o.a. Gründen kam der Boyant-Gradient für die Untersuchung von Patientenblut daher ebenfalls nicht zum Einsatz.

Boyant-Gradient GFAP-AP-ICC Versuch A

CellTracker™

Versuch B

Neubauer Zählkammer Versuch C

Anzahl U373: 1.000 1.500 250.000

Verdünnt in: 5 ml Vollblut 5 ml Vollblut 5 ml Medium (Gibco) Färbung: GFAP-alkalische

Phosphatase

CellTracker™ Trypan blue

Auswertung: Durchlicht-Mikroskop Fluoreszenz-Mikroskop Neubauer Zählkammer

Wiederfindungsrate: 31% 66% ~90%

Abbildung 12: Wiederfindungsraten Boyant density gradient

3.1.2.3. Ficoll-Gradient

Ob sich Tumorzellen glialen Ursprungs mit dem Ficoll-Gradienten anreichern lassen, war ebenfalls nicht bekannt. Zur Bestimmung von Wiederfindungsraten wurden erneut

„Spiking-Versuche“ mit der Zelllinie U373 durchgeführt. Die angefertigten Zytospins wurden mit anti-GFAP (Dako) inkubiert und anschließend erfolgte die chromogene

Visualisierung mit alkalischer Phosphatase. Die derart bearbeiteten Zytospins konnten am Automated Cellular Imaging System ACIS (Chroma Vision) ausgewertet werden.

Für dieses Verfahren wurde eine Wiederfindungsrate von 67% bestimmt. Alternativ wurden Wiederfindungsraten mit Immunfluoreszenzfärbungen von anti-GFAP(Dako) (79%), anti-GFAP (Molecular Probes) (ca. 40%), anti-GFAP (Dako) und anti-p53 (Calbiochem) (ca. 75%), anti-GFAP (Dako) und anti-EMMPRIN (BD Biosciences) (ca.

80%) bestimmt. Weiterhin wurde ein Versuch mit dem Fluoreszenzfarbstoff CellTracker™ durchgeführt. Hierbei konnten bis zu 83% der Zellen wiedergefunden werden. Bei Versuchen zur Optimierung der Anreicherung mit dem Ficoll-Gradienten wurden ebenfalls Zytospins der zu verwerfenden Überstände angefertigt. Bei der Untersuchung des Überstandes der Hank’s Solution konnten nach der Zentrifugation einige U373-Zellen (8,5% der eingesetzten Zellen) entdeckt werden. Die Dauer der Zentrifugation nach Zugabe von Hank’s Solution wurde daher von 10 auf 15 Minuten erhöht.

Ficoll-Gradient GFAP-AP-ICC GFAP-IF CellTracker™

Anzahl U373: 5.000 5.000 3.000

Verdünnt in: 15 ml Vollblut 15 ml Vollblut 15 ml Vollblut Färbung: GFAP-alkalische

Phosphatase

GFAP

Immunfluoreszenz

CellTracker™

Auswertung: Automated Cellular Imaging System ACIS (Chroma Vision)

Fluoreszenz-Mikroskop Fluoreszenz-Mikroskop

Wiederfindungsrate: 67% 79% 83%

Abbildung 13: Wiederfindungsraten Ficoll-Gradient

3.1.2.4. Vergleich der Ergebnisse

Im Vergleich der Gradienten konnten mit dem Ficoll-Gradienten die höchsten Wiederfindungsraten erzielt werden. Die Anreicherungsraten von Glioblastom-Zellen waren höher, wenn eine Detektion der Glioblastom-Zellen mit Hilfe der Immunfluoreszenz durchgeführt wurde als wenn eine chromogene Detektion der Glioblastom-Zellen erfolgte. Die meisten Zellen konnten durch Markierung mit CellTracker™ wiedergefunden werden. Dies lässt sich dadurch erklären, dass bei diesem Verfahren keine Färbung der Zytospins mit eventuellem Verlust von Zellen notwendig ist. Des Weiteren ist die Markierung mit CellTracker™ unabhängig von der Expression von GFAP in den gesuchten Zellen. Dieser Vorteil bei der Bestimmung von Wiederfindungsraten besteht jedoch nur bei den in-vitro-Versuchen mit Zelllinien. Der Farbstoff kann durch Inkubation von Zellkulturen in lebende Zellen aufgenommen werden und kann nach Binden an Thiolgruppen die Zellmembran nicht mehr passieren.

Da die Markierung der Zellen also vor dem Verdünnen in Probandenblut und der Anreicherung über Dichtegradienten erfolgt, kann er nicht zur Detektion CTC im Patientenblut eingesetzt werden.

Die Aufnahme von CellTracker™ durch die Zellen hat jedoch auch einen negativen Aspekt. Nach dem Einschleusen dieses Farbstoffes sind die U373-Zellen stark deformiert, so dass nicht mehr mit Sicherheit zwischen vitalen und avitalen Zellen unterschieden werden kann. In der Folge gestaltet sich die genaue Bestimmung der eingesetzten Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Kammer schwierig. Weiterhin fand sich bei allen Gradienten auf vielen der untersuchten Zytospins nach den Färbungen GFAP-positiver Zelldetritus. Dies lässt vermuten, dass einige der gespickten Tumorzellen der mechanischen Belastung während der Zentrifugationsschritte nicht standhalten. Dies würde einen Teil der nicht wiedergefundenen Zellen erklären.

Aufgrund der oben beschriebenen Ergebnisse wurde der Ficoll-Gradient für die Anreicherung CTC aus Patientenblut ausgewählt, da hier die höchste Wiederfindungsrate erzielt werden konnte. Weitere Vorteile sind ein geringerer Zellverlust bei den Färbungen durch geringere Anzahlen von Thrombozyten in den

angereicherten Zellsuspensionen sowie die Möglichkeit zur automatischen Auswertung mit dem ACIS System.