Oligonukleotidsequenzen
(Die Teil-Sequenzen zur Synthese des synthetischen Gens sind hier nicht aufgeführt)
Bezeichnung des
Oligonukleotids 5’→→→→3’-Sequenz
GH1 GH2
CGGGATCCCGCGATGCGGGAGTCTGAGCCT GCTCTAGAGCTACCAACCATAAACAAT GH13b
GH14b
ATGGCTCGCCAACATCGTCTTC GTAAGGCAGGCCGATATACAG
GH16 TCTAGAAAACTCAAACATCGAAGAGT
GH18 GAATTCGGCACGAGAGAAGCAATTTAT
GH19 GH20
CATGCCATGGATTGTTCTGTGGAGTTGGCA
GCTCTAGAGTATACTTTCCCATTTGGCTGTTGGCTGATG GH21
GH22
CCCAAGCTTGTCAACATGGTGGAGCACGACACT
CCCAAGCTTCCCGGGTCACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAG GH23
GH24
ATGAGAATTGGTATTTTTTCGGAAGCG CTACTTTTTATTCAATTTTTTGTTATTTTTATC GH25
GH26
GTTAACATCGACGTCGAGCACATTGCC GTTAACTGGTGGTAGCATGCTGCT GH27
GH28
ATGAAAGTCGCAATATTTACAG CAGCCCATTTGTTTTGTGCC GH29
GH30
ATGGTTACTCAAAATAAAAAG TTATTTAACGAAGAATCTTGC GH35
GH36
CGGGATCCTTTGCAAATGCAAGAGCCAAC AAGGCCTGAAAACTATAAGAAACCAGAAAGC GH37
GH38
CTAGCTAGCCTTTGCAAATGCAAGAGCC AAGGCCTTTCCTGGGTAAAAGGAGATTT GH47
GH48
ATGAGAGTTGGACTTTTTACAG TTAGGATTGACCCCATTAGTC GH49
GH50
ATGAACCCTCTGAGAATCGG CCTTTCCTGATTCAACATCTG GH55
GH56
ATGAACATAGCGATGTTCAGC TCACCTCCAGATTCTGTCTTC GH57
GH58
ATGATCAAAGTACTTCACATC TCAGAGAACATTTCCCTTAATG GH65f-20
GH65r-20
ATGGTCACCCAGAACAAGAAG
GACAGTGGCCACAGGGATGTTGATGTTGAACTGCTC
GH65f-21 GTTCAACATCAACATCCCTGTGGCCACTGTCATGAC
GH65r-21 GGCCACATAGTACCTCGTCGAGTACGGTGTGATCCAG GH65f-22
GH65r-22
GAACTGGATCACACCGTACTCGACGAGGTACTATG GGAGACACCAAATGCACCAGCAGACATGAGGATGG GH65f-23
GH65r-23
GCTGGTGCATTTGGTGTCTCCAAGGGATTTGACAC GCTATGACCAATGAGATCAAGGAGATCACGGCAG
GH65f-24 CTTGATCTCATTGGTCATAGCTCCCAGCCTCAGGAA
GH69msF Gh69msR
GGTACCTGAATTAAGAAGGGAGC GGGCCTTAACCTATGACATAAAG GH69maF
Gh69maR
TTAATTAATGAATTAAGAAGGGAGC CCCTGGACAGGGATTTTC
GH69Leader-ntF GH69Leader-ntR2
GGGCCCATGATGCAGCATTCTTCTTC ACCTAGGATAAGCACCTTTTTCGGAGG GH69dr1225F
GH69dr1225R
ATCCTAGGTATGAACCCTCTGAGAATC GGATCCTCACCGGCCATACGCGG GH69tm0744F
GH69tm0744R
ATCCTAGGTATGAACATAGCGATGTTCAG GGATCCTCACCTCCAGATTCTGTC GH69saysynF
GH69saysynR
ATCCTAGGTATGGTCACCCAGAACAAG GGATCCTTACTTGACAAAGAACCTAG
GH69syn3R TGTACATGTTCCTGAAGTACTTGAAGCTGTTG
GH71dr1076F GH71dr1076R
ATCCTAGGTATGGCTCGCCAACATCGTC GGATCCGTAAGGCAGGCCGATATAC GH74ct1882F
GH74ct1882R
ATCCTAGGTATGAAGGTAGCCTTGTATGC GGATCCTCACCGTCTGGCTTTGGCGGC GH74ct0548F
GH74ct0548R
ATCCTAGGTATGTTTTGCAAGGTCATGAAAAT GGATCCCTACTGAGCTTTGCGCTCG
GH74ct0225F GH74ct0225R
ATCCTAGGTATGGCCGCCGAAGCCCTC GGATCCTCACGTGCCTTTTTTTCGATC GH74ct0226F
GH74ct0226R
ATCCTAGGTATGGCCGCCCGCAAGCTTT GGATCCTCATCGTTTCGCCGCCAC GH74chlo2029F
GH74chlo2029R
ATCCTAGGTATGACTAATGCTATGAATCG GGATCCTTATGATCCCCCAACCGG GH74chlo2030F
GH74chlo2030R
ATCCTAGGTATGGGAGATAGATCTATGCC GGATCCTTAGTCATGGCGGTGACTC GH74chlo2464F
GH74chlo2464R
ATCCTAGGTATGTCGATCAGTCAAACGC GGATCCTCATGCTGAACTCCTCGAT GH74chlo0149F
GH74chlo0149R
ATCCTAGGTATGAACGCTACCCATCCAC GGATCCTCAGGTTGGCCCAAAAATTTTTG GH74chlo1337F
GH74chlo1337R
ATCCTAGGTATGCGTATCGCGTTGATTTG GGATCCTCACCCGCGGCCAGGAAC GH74chlo1537F
GH74chlo1537R
ATCCTAGGTATGCGCATCGCTTTTCTTG GGATCCTCAACCACGTGTGACGGT GH74chlo1567F
GH74chlo1567R
ATCCTAGGTATGCGCATTCTCATCCCTTC GGATCCTTATGGTTGCTTTGACTGGC GH74chlo1798F
GH74chlo1798R
ATCCTAGGTATGATTCGTTTTGCAATCGATG GGATCCTCAGAATCGTCTGATTAACTG
GH74chlo4056R GGATCCTCAGTTAGTTTGCAGGACAG
Gh75syn3F CCATGGTCCTAGGTATGGTCACCC
GH75nptIIF GH75nptIIR
GGATCCCACGCTGCCGCAAGCACT AAGCTTAACCCCAGAGTCCCGCTC MCS1-F
MCS1-R
GATCTGGTACCCCGGGCCTTAATTAAG CTTAATTAAGGCCCGGGGTACCA MCS2-F
MCS2-R
AGATCTAGCTAGCTGGGCCCAAAGGCCTTTATCCTAGGTTTA ACCATGGACTAGTCGGATCCGTACGTATAAACCTAGGATAAAG CH6
CH7
TTTCCATGGATTGTTCTGTGGAGTTG TTTGGATCCCTAAATAAGCCCTCTG
Agro1 ATGGGAGTGGAACTGGCCAGCATG
Agro2 TTATTCCGCAGGCGGACCCGCCAG
Meso1 ATGGAACTCACTCTCATAGCCGCC
Meso2 TCAGGCGCGCGACGACGCCTCTTC
AgroN CCATGGGAGTGGAACTGGCCAGCA
AgroB GGATCCTTATTCCGCAGGCGGACC
AGROK GGTACCGGAATCAGTTGACCGGTG
AGROE GATATCTCCCAAGCTTTCGGCGGT
AGRO2N GCGGCCGCTGGCTCGCAGGGCCGC
AGRO2S GAGCTCTTATTCCGCAGGCGGACC
STA GATATCGTGGTTACTCAAAATAAA
STAS CCCGGGTTATTTAACGAAGAATCT
STREPS CCCGGGTATGCGCTCACGCAACTG
STREPN GCGGCCGCATTATTTGCCGACTAC
12F CGTGAAACCGTTACCAAGATG
12R TATGACCGTTACCGAATGAGC
13F AAGAGATTTATGGAAAGGTTCC
13R TCAGCTTTCCGGCGTAACTC
14F CGAATTCCATGGAATCGATTG
14R ACAACATCGATTTGCCCTGTG
15F GAGAACCTGCGTGCAATCC
15R ACTGACTTCAGGTGAGAGTC
16R TATCAGGACATAGCGTTGGC
Polynukleotidsequenz des synthetischen Gens (Version 3)
(Die unterstrichene Base führt zu einem Aminosäureaustausch)
ATGGTCACCCAGAACAAGAAGATCCTCATCATCACTGGCTCCTTTGGCAATGGTCACATGCAGGTCAC CCAGTCCATTGTCAACCAGCTCAATGACATGAACTTGGACCATCTCTCTGTCATTGAGCATGATCTCT TCATGGAGGCTCATCCCATCCTCACCTCCATCTGCAAGAAGTGGTACATCAACAGCTTCAAGTGCTTC AGGAACATGTACAAGGGCTTCTACTACTCCAGGCCGGACAAGCTGGACAAGTGCTTCTACAAGTACTA TGGGCTCAACAAGCTCATCAACCTCCTCATCAAGGAGAAGCCGGATCTCATCCTCCTCACCTTCCCGA CACCTGTCATGTCTGTCCTCACTGAGCAGTTCAACATCAACATCCCTGTGGCCACTGTCATGACTGAC TACAGGCTCCACAAGAACTGGATCACACCGTACTCGACGAGGTACTATGTGGCCACCAAGGAGACGAA GCAGGACTTCATTGATGTGGGAATTGATCCCTCCACTGTCAAGGTCACTGGAATCCCAATTGACAACA AGTTTGAGACACCGATCAACCAGAAGCAGTGGCTCATTGACAACAACTTGGACCCGGACAAGCAGACC ATCCTCATGTCTGCTGGTGCATTTGGTGTCTCCAAGGGATTTGACACGATGATCACTGACATCCTTGC CAAGTCTGCCAATGCTCAGGTGGTCATGATCTGTGGCAAGTCCAAGGAGTTGAAGAGGTCCCTCACTG CCAAGTTCAAGCTCACCAGGATGTACCTCATCCTTGGTTACACCAAGCACATGAATGAGTGGATGGCT AGCTCCCAGCTCATGATCACCAAGCCAGGTGGAATCACCATCACTGAGGGCTTTGCCAGGTGCATTCC CATGATCTTCCTCAACCCTGCTCCAGGTCAGGAGCTTGAGAATGCTTTCTACTTTGAGGAGAAGGGCT TTGGCAAGATTGCTGACACTCCTGAGGAGGCCATCAAGATTGTGGCTTCCCTCACCAATGGCAATGAG CAGCTCACGAACATGATCAGCACGATGGAGCAGGACAAGATCAAGTACGCTACCCAGACCATCTGCCG TGATCTCCTTGATCTCATTGGTCATAGCTCCCAGCCTCAGGAAATCTATGGCAAGGTGCCCTTGTATG CTAGGTTCTTTGTCAAGTAA
Polynukleotidsequenz des ORFs dr1225
amplifiziert aus genomischer DNA von D. radiodurans – mit Abweichungen zur entsprechenden Sequenz in GenBank.
ATGAACCCTCTGAGAATCGGCCTGTTTACCGACACCTTCCTCCCCGACCAGAACGGCATCGTGACCAG CGTCTGCCTGCTGAGCGACGAGCTTCGCGCCCTGGGACACCGGGTGGATGTGGTCGCCCCGCAGTTTC CCGAGCATCTCGACCGCCGCGCCGACGTGCGCCGGGTGGCGAGCGTGCGTTATCCGCTGCTGCCGACC TACCGGCTGGCGTGGCCCACCCGCAAGTCCTTCGAGCAGCGCTACGACGTGGTCCACACCCACACGCC GCTGACTCTGGGCCTGGCCGGGGCGCGGCTGGCCCGCAAGTGGCGGGTGCCGCACGTGGCGACCTACC ACACCCATCTGGAGGCCTACACCCACTACGTGCCAGGCATGACGCAGCTCAACCGCGCCGTTCACTTC ATGCCCAGAGTCGTCGGGCGGCTCTACGGCGAGGCCGACGCCGTCATCACGCCGACGGCGGGCACCCT GGACACGCTGCGGCAGGCCGGAATCGAGGACGCCGTGGTGATTCCCACCAGCATCGACCCGGCGGTCC TGGAAGCCGCTCCGCCCATCGCCGACCCCTGGCCCTCCGGCACGCGCCGGCTGCTCACGGTGGGGCGG CTGGCCCGCGAAAAGCGCTTCGATCTGGTGCTCGACGCGCTCGCGCAGCTTCCCGGCGCCCACCTCGT GATGCTGGGAGAAGGCCCGGAACGTGCCCACCTCGAGGACCACGCCGAGCGGCTGGGGGTCTCGGGGC GCGTCACCTTCGTGGGTGTGCGGCCCTGGACCGAAATCGGGGCGTACTACCGCCTCGCCGAGCTGTTC GTCTTCGCCTCGGACACCGAGACGCAGGGGCTGGTGCTGCAAGAAGCGCAACTCATGGGTGTGCCGGT GGTCGCGGTGGGCGCCCGGGGCACCCTGACCGGCGTGCAGAGCGGCTACAGCGGCTATCTGGTGCCTC CCGGCGACGTGGCCGGGCTGGTGGGGCGGTCGCTGGAGCTGCTGAGCAGTCCCGCCGAGCACCAGCGT TTTTCCCGGCAGGCCCGCGAATTCGGGGGACGGACCACGCCCGCCGGGGTGGCGCGGCAGGTGCTGGC GGTGTACGCCCGGGTGCTGGGCCGGTCCGACCTTACTCTGCCGGGTCCTGGTCAGGGGGCGGCGGAGG AAGGCGATCATCCCCGAAATACCCCCGCGTATGGCCGGTGA
Transformationskonstrukte
Stellvertretend für die zahlreichen Konstrukte zur Transformation von A. tumefaciens, P. patens, Synechococcus und A. thaliana wurde jeweils ein entsprechendes Konstrukt ausgewählt. Der Unterschied zwischen diesen und den nicht gezeigten Plasmiden besteht nur in der Verwendung unterschiedlicher ORFs. Die Konstrukte zur Transformation von E. coli, S. cerevisiae und P. pastoris sind nicht aufgeführt, ebenso wenig alle Konstrukte zur Subklonierung von PCR-Produkten und DNA-Fragmenten.
pMGDSko
5934 bps
1000
2000
3000 4000
5000
EcoRI
EcoRI
'MGDS
35S-T
nptII
35S-P MGDS'
Amp
Konstrukt : pMGDSko
zur Deletion der βGalD-Synthase in P. patens
Merkmale Beschreibung
‘MGDS 5’-Fragment der βGalD-Synthase aus P. patens
35S-T 35S-Terminator
nptII Kanamycin-Resistenz
35S-P 35S-Promotor
MGDS’ 3’-Fragment der βGalD-Synthase aus P. patens
Amp Ampicillin-Resistenz
pDGDSko
6129 bps
1000
2000
3000 4000
5000
6000
BamHI
BamHI
'DGDS
35S-T
nptII
35S-P DGDS'
Amp
Konstrukt : pDGDSko
zur Deletion der putativen αGalβGalD-Synthase in P. patens
Merkmale Beschreibung
‘DGDS 5’-Fragment der putativen αGalβGalD-Synthase aus P. patens
35S-T 35S-Terminator
nptII Kanamycin-Resistenz
35S-P 35S-Promotor
DGDS’ 3’-Fragment der putativen αGalβGalD-Synthase aus P. patens
Amp Ampicillin-Resistenz
pUCd6Lmaln
8707 bps
2000
4000 6000
8000
EheI NarI KasI BbeI BglI PvuI
BamHI HpaI
EcoRI BstXI
AlwNI BalI
MunI BspLU11
NspV
BssHII
BalI KasI EheI NarI BbeI XhoI AvaI PpuMI BseRI
MunI
BstXI BssHII BsaI XhoI AvaI PpuMI BseRI BamHI NspV SspI AatII
HpaI EcoRI BspLU11
AlwNI
BsaI BglI Psp1406
PvuI Psp1406
SspI AatII
'D6-desat-frag
35S-T
nptII
35S-P 35S-T MGlucD
Leader 35S-P
D6-desat-frag'
Konstrukt : pUCd6Lmaln
zur Expression der αGlcD-Synthase aus A. laidlawii als Fusionsprodukt mit einer Chloroplasten-Leadersequenz in P. patens mit der ∆6-Desaturase als Insertionsplattform
Merkmale Beschreibung
‘D6-desat-frag 5’-Fragment der ∆6-Desaturase aus P. patens
35S-T 35S-Terminator
nptII Kanamycin-Resistenz
MGlucD αGlcD-Synthase aus A. laidlawii Leader Chloroplasten-Leadersequenz
D6-desat-frag’ 3’-Fragment der ∆6-Desaturase aus P. patens
pUCd6maln
8319 bps
2000
4000 6000
8000
BclI MluI
BstXI
BsgI
RsrII NgoMI NaeI BssHII BsaAI TthI XmaIII XhoI AvaI
SpeI Ppu10I BsrGI NsiI
Bsu36 EcoNI
Eco47-3 Bst1107 KpnI Asp718
BsaI
'D6-desat-frag
35S-T
nptII
35S-P 35S-T mglcd_al
35S-P D6-desat-frag'
Konstrukt : pUCd6maln
zur Expression der αGlcD-Synthase aus A. laidlawii in P. patens mit der ∆6-Desaturase als Insertionsplattform
Merkmale Beschreibung
‘D6-desat-frag 5’-Fragment der ∆6-Desaturase aus P. patens
35S-T 35S-Terminator
nptII Kanamycin-Resistenz
mglcd_al αGlcD-Synthase aus A. laidlawii
D6-desat-frag’ 3’-Fragment der ∆6-Desaturase aus P. patens
pBa1na5
6273 bps
1000
2000
3000 4000
5000
6000
DraIII
KpnI Asp718
AgeI PpuMI
AatII
NdeI NheI
AvaI Eco47-3
Bsp120I ApaI MunI NspV RsrII
PstI BglII BstAPI
SpeI NotI BstXI SacI Ecl136 BspLU11
5'-Promotor
nptII 3'-Gcs
Amp
Konstrukt : pBa1na5
zur Deletion der Gcs in A. tumefaciens
Merkmale Beschreibung
5’-Promotor 5’-Bereich des Gcs-Promotors als linker flankierender Bereich
nptII Kanamycin-Resistenz
3’-Gcs 3’-Bereich des Gcs-ORF als rechter flankierender Bereich
Amp Ampicillin-Resistenz
pBa1saySSa2
7774 bps
1000
2000
3000 4000
5000 6000
7000
KpnI Asp718
PpuMI AatII
NheI SphI
Bsp120I ApaI
TthI MunI NspV
BglII
EcoRI EcoRV XbaI BsrGI PacI
XmaI SmaI BstEII
Bpu1102 NotI
SacI Ecl136 SapI
Gcs-Promotor
Strep-Spec GlcT 3'-Gcs
Amp
Konstrukt : pBa1saySSa2
zur Expression der βGlukosyltransferase aus S. aureus als Reporter-Gen unter dem nativen gcs-Promotor in A. tumefaciens
Merkmale Beschreibung
Gcs-Promotor 5’-Bereich des Gcs-Promotors als linker flankierender Bereich GlcT βGlukosyltransferase aus S. aureus als Reporter-Gen
Strep-Spec Streptomycin/Spectinomycin-Resistenz
3’-Gcs 3’-Bereich des Gcs-ORF als rechter flankierender Bereich
Amp Ampicillin-Resistenz
pTnVAt-GlcT
8720 bps
2000
4000 6000
8000
PflMI SplI
NheI BseRI
EcoNI BsaI AgeI BspLU11
Bst1107 NdeI BspLU11
AhdI BsaI
BsaI
BsaI PmeI SalI SnaBI HindIII RsrII PstI
BglII BamHI BsaI AscI
BsaI EcoRI BsaI BseRI
AvrII
EcoRV ApaI Bsp120I BstEII
PflMI NsiI Ppu10I
pVS1-REP
Amp nptII
Gcs
LacI
Konstrukt : pTnVAt-GlcT
zur Überexpression der Gcs in A. tumefaciens
Merkmale Beschreibung
pVS1-REP Replikationsursprung zur Etablierung des Plasmids in A. tumefaciens
Amp Ampicillin-Resistenz
nptII Kanamycin-Resistenz
Gcs Gcs aus A. tumefaciens
LacI LaqIq-Gen zur Synthese des Repressors
pTn-chlo2030
6693 bps
1000
2000
3000 4000
5000 6000
AvrII
PmaCI
BsmI AvaI
BamHI
XmaIII PstI BalI
NgoMI NaeI RsrII HindIII SnaBI PmeI ScaI
PvuI BglI AhdI BspLU11
NdeI Bst1107
Ppu10I NsiI PflMI
MluI BstEII Bsp120I
ApaI EcoRV
chlo2030
nptII
Amp LacI
Konstrukt : pTnchlo2030
zur Expression der β-Glukosyltransferase chlo2030 aus C. aurantiacus in Synechococcus
Merkmale Beschreibung
chlo2030 β-Glukosyltransferase chlo2030 aus C. aurantiacus
Amp Ampicillin-Resistenz
nptII Kanamycin-Resistenz
LacI LaqIq-Gen zur Synthese des Repressors
pCMsLnt2030
12345 bps
2000
4000
6000 8000
10000
12000
SplI
EcoNI AgeI
Bst1107
Ppu10I NsiI HpaI BspEI RsrII
EcoRI KpnI Asp718 SrfI XmaI SmaI PacI Bsp120I
ApaI AvrII
PmaCI BamHI
SpeI HindIII
PmeI
pVS1-REP
pBR322 Ori Cmr R
35S TerLB Plant Kan R 35S-P
35S-P ms intronma
OCS 35S-P
leader-nt chlo2030
OCS RB
Konstrukt : pCMsLnt2030
zur Transformation von A. thaliana mit Kassetten zur Gen-Inaktivierung von MGD1 und zur Expression der β-Glukosyltransferase chlo2030 aus C. aurantiacus als Fusionsprotein mit einem Chloroplasten-Leaderpeptid
Merkmale Beschreibung Merkmale Beschreibung
pVS1-REP Replikationsursprung für A.
tumefaciens
Cmr R Chloramphenicol-Resistenz für Bakterien
pBR322 Ori Replikationsursprung für E. coli 35S Prom 35S-Promotor
35S Ter 35S-Terminator OCS OCS-Terminator
Plant Kan R Kanamycin-Resistenz für Pflanzen
ms sense-Fragment von MGD1
LB Left Border intron Intron
RB Right Border ma antisense-Fragment von MGD1
leader-nt Chloroplasten-Leadersequenz chlo2030 β-Glukosyltransferase chlo2030 aus C. aurantiacus
pCDsLchlo2030
12830 bps
2000
4000
6000 8000
10000
12000
SplI
EcoNI AgeI
Bst1107
Ppu10I NsiI HpaI BspEI RsrII
EcoRI StuI
PacI Bsp120I
ApaI AvrII
PmaCI BamHI
HindIII PmeI
pVS1-REP
pBR322 Ori Cmr R
LB 35S Ter Plant Kan R 35S-P
35S-P ds intronda
OCS 35S-P
leader-nt chlo2030
OCS RB
Konstrukt : pDMsLnt2030
zur Transformation von A. thaliana mit Kassetten zur Gen-Inaktivierung von DGD1 und zur Expression der β-Glukosyltransferase chlo2030 aus C. aurantiacus als Fusionsprotein mit einem Chloroplasten-Leaderpeptid
Merkmale Beschreibung Merkmale Beschreibung
pVS1-REP Replikationsursprung für A.
tumefaciens
Cmr R Chloramphenicol-Resistenz für Bakterien
pBR322 Ori Replikationsursprung für E. coli 35S Prom 35S-Promotor
35S Ter 35S-Terminator OCS OCS-Terminator
Plant Kan R Kanamycin-Resistenz für Pflanzen
ds sense-Fragment von DGD1
LB Left Border intron Intron
RB Right Border da antisense-Fragment von DGD1
leader-nt Chloroplasten-Leadersequenz chlo2030 β-Glukosyltransferase chlo2030 aus C. aurantiacus