A1 Spezifität der Hydrolyse der Substrate (Xaa-Pro)2-R110 mit Xaa = Leu, Ser und Cha durch DP IV der myeloischen Zellinie U-937 und deren Zellysat
Abb. A1 Darstellung der Spezifität der Hydrolyse von (Xaa-Pro)2-R110 mit Xaa = Leu, Ser und Cha durch DP IV intakter U-937-Zellen (A) und des U-937-Zellysats (B) mittels DP IV-spezifischer Inhibitoren:
Lys[Z(NO2)]-thiazolidid (◆◆◆◆), Lys[Z(NO2)]-pyrrolidid (▲▲▲▲) und Lys[Z(NO2)]-piperidid (■■■)■ (Meßbedingungen: PBS, pH = 7.2, U-937-Zellen 106 Zellen/ml, Inkubation 30 min, 37°C;
Fluoreszenzplattemleser, λEx = 488 nm, λEm = 525 nm, Lampenspannung 1.8 V bis
2.0 V)
Auf die Spezifität der Hydrolyse von (Gly-Pro)2-R110 und (Ala-Pro)2-R110 durch DP IV intakter U-937-Zellen und des U-937-Zellysats wurde unter HERMANNS [1995] eingegangen.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
A
(Leu-Pro)2-R110
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
(Ser-Pro)2-R110
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
B
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
(Ser-Pro)2-R110
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80
100 A
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80
100 B
(Leu-Pro)2-R110
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
(Cha-Pro)2-R110 B
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80
100 A
(Cha-Pro)2-R110
Restaktivität [%]
Inhibot [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
A2 Hydrolyse der Substrate Xaa-Pro-R110-Y mit Xaa = Gly und Ala und Y = Y1 bis Y9
Abb. A2 Hydrolyse der Substrate Xaa-Pro-R110-Y mit Xaa = Gly und Ala und Y = Y1 bis Y9
(Meßbedingungen: PBS, pH = 7.2, U-937-Zellen einer Aktivität von 25 pkat/ml Ansatz; Inkubation 30 min, 37°C; Fluoreszenzplattenleser: λEx = 488 nm; λEm = 525 nm; Lampenspannung 2.0 V)
Gl y-Pro-R1 10 -C O-C6H4-C H2C l
Gly -P ro -R 11 0-COC H2C l Gly -P ro -R 11 0-COC H3
Gl y-Pro-R1 10 -C O(C H2)5C4H2O2N Ala-Pro-R1 10 -C O(C H2)5C4O2NC l2 Gl y-Pro-R1 10 -C O(C H2)3C l
Substrat [10-6 mol]
Gl y-Pro-R1 10 -C O(C H2)5Br
0. 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5
Gl y-Pro-R1 10 -C O(C H2)5C l
0 2 0 4 0 6 0
8 0 Gl y-Pro-R1 10 -C O(C H2)3C4H2O2N
v [∆F / min]
A3 Spezifität der Hydrolyse der Substrate Xaa-Pro-R110-Y mit Xaa = Gly und Ala und Y = Y1 bis Y9 durch DP IV der myeloischen Zellinie U-937
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
Gly-Pro-R110-CO-CH2Cl
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
Gly-Pro-R110-CO-CH3
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
Gly-Pro-R110-CO(CH2)3Cl
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 20 40 60 80 100
Gly-Pro-R110-CO(CH2)4Br
Gly-Pro-R110-CO(CH2)4Cl
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0 20 40 60 80 100
N O
O Gly Pro R110 C
O (CH2)3
Abb. A3 Darstellung der Spezifität der Hydrolyse von Xaa-Pro-R110-Y mit Xaa = Gly und Ala und Y = Y1 bis Y9 durch DP IV intakter U-937-Zellen mittels DP IV-spezifischer Inhibitoren:
Lys[Z(NO2)]-thiazolidid (◆◆◆◆), Lys[Z(NO2)]-pyrrolidid (▲▲▲▲) und Lys[Z(NO2)]-piperidid (■■■■)
(Meßbedingungen: : PBS, pH = 7.2, U-937-Zellen 106Zellen/ml, Inkubation 30 min, 37°C;
Fluoreszenzplattemleser: λEx = 488 nm, λEm = 525 nm, Lampenspannung 1.8 V bis 2.5 V)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0 20 40 60 80 100
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0 20 40 60 80 100
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 20 40 60 80 100
Restaktivität [%]
Inhibitor [10-4 M]
Gly Pro R110 C O
(CH2)5 N O
O
N O
O Cl
Cl Pro R110 C
O (CH2)5 Ala
A4 Beeinflussung der Hydrolyse zellulär gebundenen Substrates durch isolierte
DP IV
0 5 10 15 20 25 30 35
relative Fluoreszenzänderung
S ub str at + Zellen + Inh ibito r + isol. D P I V ( 25 p kat/m l) S ub str at
+ Zellen + Inh ibito r S ub str at
+ Zellen + Inh ibito r S ub str at
+ Zellen
W eiter ink ub ation 3 0 m in bei 3 7 °C I nk ub ation 20 min , 3 7 ° C,
3 -m aliges W aschen
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
relative Fluoreszenzänderung
Sub str at + Zel len + I n hib itor + iso l. D P I V ( 25 pk at/ml) Sub str at
+ Zel len + I n hib itor Sub str at
+ Zel len + I n hib itor Sub str at
+ Zel len
W eiter in ku batio n 3 0 m in b ei 3 7 ° C I n ku batio n 2 0 min , 37 ° C,
3 - malig es W asch en 0
5 10 15 20 25 30 35 40
Sub str at + Zellen + Inh ibito r + i sol. D P IV (25 p kat/m l) Sub str at
+ Zellen + Inh ibito r Sub str at
+ Zellen + Inh ibito r Sub str at
+ Zellen
W eiter ink ub ation 3 0 min bei 3 7 °C I nk ub ation 20 min , 3 7 ° C,
3- m aliges W aschen
relative Fluoreszenzänderung
0 5 10 15 20 25 30 35 40
relative Fluoreszenzänderung
W eiteri nk ub at ion 30 min bei 37 °C I nk ub at ion 2 0 m in, 3 7 °C ,
3- malig es W as ch en
S u bs trat + Z ellen + Inh ibito r + is ol. D P IV (2 5 p ka t/m l) S u bs trat
+ Z ellen + Inh ibito r S u bs trat
+ Z ellen + Inh ibito r S u bs trat
+ Z ellen
C R110
O
(CH2)4Cl R110 C
O
(CH2)3Cl
N O
O R110 C
O
(CH2)3 N
O
O R110 C
O (CH2)5
Abb. A4 Beeinflussung der Hydrolyse zellulär gebundenen Substrates durch isolierte DP IV
(Meßbedingungen: PBS, pH = 7.2, Zellen 106 MNZ/ml Ansatz, [Xaa-Pro-R110-Y] = 5⋅10-6 M, [Lys[Z(NO2)]-thiazolidid] = 10-4 M; Durchflußzytometer: λEx = 488 nm, λEm = FL1 = 530/30 nm)
0 20 40 60 80
relative Fluoreszenzänderung
Sub strat + Z ellen + In hib itor + isol. DP IV (25 pk at/ml) Sub strat
+ Z ellen + In hib itor Sub strat
+ Z ellen + In hib itor Sub strat
+ Z ellen
Weiterinkubation 30 m in b ei 3 7 ° C Inku bation 20 min , 37 ° C,
3-m a liges W aschen
N O
O
Cl
Cl R110 C
O (CH2)5
A5 1H-NMR-Daten der Verbindungen (Xaa-Pro)2-R110 (Xaa = Abu, Leu, Ser, Lys, Cha), der Verbindungen und Xaa-Pro-R110-Y (Xaa = Gly und Y = Y1 bis Y6) und von Nεεεε-Biotin- bzw. 4(5)-Carboxyfluorescein-markiertem Lys-2-cyano-pyrrolidid
Tab. A5.1: H-NMR Daten der Verbindungen der Struktur (Xaa-Pro)2-R110 (Xaa = Abu, Leu, Ser, Lys und Cha)
(Xaa-Pro)2-R110 Xaa • [ppm]
NH2 C• H C• C• C• C•
(trans)
(Abu-Pro)2-R110 8.03 4.17 1.78 0.98
(C•H2) (C• H3)
-(Leu-Pro)2-R110 8.03 4.13 1.56 1.81 0.96
-(CβH2) (CγH) (CδH3, Cδ‘H3) (Ser-Pro)2-R110 8.03 4.20 3.84 5.53
3.59 (C•OH) -
-(C•H2)
(Lys-Pro)2-R110 8.04 4.14 1.72 1.44 1.56 2.77
(C•H2) (C•H2) (C•H2) (C•H2)
(Cha-Pro)2-R110 8.19 4.17 1.67 0.89 1.20 1.90
(CβH) 1.67 1.67 1.67
(2CγH2) (2CδH2) (CεH2) (Xaa-Pro)2-R110 Pro • [ppm]
C•H C• H2 C• H2 C•H2 CONH
cis/trans [%]
(Abu-Pro)2-R110 4.50 2.24 2.02 3.76 10.52 (trans) 1.89 1.89 3.57 (trans)
4.64 10.67
(cis) (cis)
93.0/ 7.0
(Leu-Pro)2-R110 4.50 2.24 2.05 3.79 10.47 (trans) 1.90 1.90 3.48 (trans)
10.75 (cis)
93.0/7.0
(Ser-Pro)2-R110 4.49 2.24 2.02 3.77 10.35 (trans) 1.91 1.91 3.59 (trans)
4.77 10.62
(cis) (cis)
88.0/12.0
(Lys-Pro)2-R110 4.50 2.24 2.03 3.75 10.52 (trans) 1.90 1.90 3.53 (trans)
4.64 10.73
(cis) (cis)
93.5/6.5
(Cha-Pro)2-R110 4.54 2.24 2.04 3.80 10.57 (trans) 1.90 1.90 3.46 (trans) 10.62
(cis)
93.0/7.0
Als Lösungsmittel wurde DMSO-d6 verwendet. Die cis/trans-Verhältnisse beziehen sich auf die Xaa-Pro-Bindung Die chemischen Verschiebungen der aromatischen Protonen des Rhodamin 110 liegen in einem Bereich zwischen 6.7 ppm und 8.1 ppm und wurden nicht zugeordnet. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich alle chemischen Verschiebungen auf die trans-Isomeren.
Tab.A5.2: 1H-NMR Daten der Verbindungen der Struktur Gly-Pro-R110-Y (Y = –COCH3, -COCH2Cl, -CO(CH2)3Cl, -CO(CH2)4Cl, -CO(CH2)4Br, -CO-C6H6-CH2Cl,)
Gly-Pro-R110-R Gly • [ppm]
NH2 C•H2
Pro • [ppm]
C• H C•H2 C•H2 C•H2CONH R = -COCH3 8.03 3.85
(cis, trans)
4.48 2.20 2.02 3.61 10.43
(trans) 1.95 1.95 3.53 10.44 (trans, R und S)
4.60 10.27 (cis, R und S)
(cis) R = COCH2Cl 7.96 3.87
(cis, trans
4.49 2.20 2.02 3.62 10.45
(trans) 1.94 1.94 3.53 10.44 (trans R und S)
4.61 10.65 (cis, R und S)
(cis) R = CO(CH2)3Cl 8.10 3.88
(cis, trans
4.50 2.20 2.04 3.62 10.45
(trans) 1.91 1.91 2.04 10.44 (trans, R und S)
4.62 10.32 (cis, R und S)
(cis) R = CO(CH2)4Cl 8.17 3.82
(cis, trans)
4.49 2.19 1.99 3.61 10.42
(trans) 1.94 1.94 3.52 10.43 (trans, R und S)
4.59 10.24 (cis, R und S)
(cis) R = CO(CH2)4Br 8.14 3.88
(cis, trans)
4.49 2.20 2.02 3.63 10.44
(trans) 1.96 1.96 3.56 10.45 (trans, R und S)
4.61 10.25 (cis, R und S)
(cis) R = CO-C6H6-CH2Cl 8.15 3.88
(cis, trans)
4.55 2.20 2.02 3.62 10.45
(trans) 1.94 1.94 3.53 10.46 (trans, R und S)
4.60 10.56 (cis, R und S)
(cis) Gly-Pro-R110-R Y • [ppm]
CONH C2 C3 C4 C5
trans (R und S), [%]
cis (R und S), [%]
R = -COCH3 10.27 2.07 (C2H3)
60.1/25.9 14 R = COCH2Cl 10.65 4.29
(C2H2)
47.3/39.2 13.5 R = CO(CH2)3Cl 10.32 2.50 2.04 3.70
(C2H2) (C3H2) (C4H2)
43.5/42.5 14 R = CO(CH2)4Cl 10.24 2.37 1.73 1.73 3.67
(C2H2) (C3H2) (C4H2) (C5H2)
44.0/41.0 15.0 R = CO(CH2)4Br 10.25 2.38 1.86 1.72 3.56
(C2H2) (C3H2) (C4H2) (C5H2)
44.7/41.3 14.0 R = CO-C6H6
-CH2Cl
Aromat CH2Cl 10.56 7.10-8.10 4.86
40.9/40.1 19.0
Die 1H-Spektren wurden in DMSO-d6 aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen der aromatischen Protonen des Rhodamin 110 wurden nicht zugeordnet. Die Angabe der cis/trans-Verhältnisse bezieht sich auf die Xaa-Pro-Bindung. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich alle chemischen Verschiebungen auf die trans-Isomeren.
Tab. A5.3: 1H-NMR Daten des Nεεεε-Biotin- und 4(5)-Carboxyfluorescein-markierten Lys-2-cyano-pyrrolidids
Verbindung Lys- δδδδ [ppm] 2-Cyano-pyr δδδδ [ppm]
Marker δδδδ [ppm]
Lys-(biotinyl)-2-cyano-pyrrolidid 3.69 (CαH); 1.49 (CβH2); 1.75 (CγH2);
1.37 (CδH2); 3.00 (CεH2); 7.70 (NεH)
4.01 (C2H); 2.33, 1.62 (C3H2); 1.90, 1.75 (C4H2); 3.56, 3.41 (C5H2)
Biotinyl-3.10 (C2H); 4.13 (C3H);
4.30 (C4H); 2.82, 2.58 (C5H2); 6.76 (N1’H); 6.65 (N3’H)
Pentanoyl-2.03 (C2H2); 1.30 (C3H2);
1.49 (C4H2); 1.62, 1.49 (C5H2)
Lys-(4(5)-carboxy- fluoresceinyl)-2-cyano-pyrrolidid
3.72 (CαH); 1.36 (CβH2); n.b. (CγH2);
1.54 (CδH2); 3.31 (CεH2); 8.77 (NεH)
4.01 (C2H); 2.34, 1.54 (C3H2); 1.90, 1.75 (C4H2); 3.56, 3.41 (C5H2)
4(5)- Carboxyfluoresceinyl-n.b.
Die 1H-Spektren wurden in DMSO-d6 aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen der aromatischen Protonen des 4(5)-Carboxyfluoresceins und von Lys-CγH2 wurden nicht zugeordnet.
Lys-(biotinyl)-2-cyano-pyrrolidid Lys-(4(5)-carboxyfluoresceinyl)-2-cyano-pyrrolidid
Lys-(biotinyl)-2-cyano-pyrrolidid liegt in einem Verhältnis von ca. 90%/10% als Isomerengemisch vor. Lys-(4(5)-carboxyfluoresceinyl)-2-cyano-pyrrolidid liegt in einem Verhältnis von ca. 64%/36% als Isomerengemisch vor. Möglicherweise handelt es sich dabei um cis/trans-Isomere bezüglich der Lys-Pyr-Amidbindung, die genaue Art der Isomerie wurde zum gegebenen Zeitpunkt nicht genauer charakterisiert.
C C C H2 C H2)3 N H H2N
H O
N C N
N H ( H N
S O
C O 2
3 4 5
1
1 ' 2 '
3 '
1 2 3 4 5
1 2 3 5 4
L ys - 2 -cya n o -p yr
b io tin yl- p e n ta n o
yl-O O O H
C O
C C C H2 C H2)3 N H H2N
H O
N C N
1 2
3 4 5 (
L ys 2 -c ya n o -p yr
4 (5 )-C a rb o xyflu o re s ce in
yl-Hiermit erkläre ich, Susan Lorey, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe. Die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen sind als solche gekennzeichnet.
Diese Arbeit wurde an keiner anderen Einrichtung zur Begutachtung vorgelegt.
Halle (Saale), den 17.05.1999
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. K. Neubert für die Überlassung des interessanten Themas, die Betreuung sowie für seine ständige Diskussionsbereitschaft und die ausgezeichneten materiellen Bedingungen.
Ebenfalls danken möchte ich Herrn Prof. Dr. S. Ansorge für die Gewährung mehrmonatiger Arbeitsaufenthalte in seiner Arbeitsgruppe, für sein reges Interesse am Fortgang der Arbeit und anregende Diskussionen. Herrn Dr. F. Bühling danke ich herzlichst für die Unterstützung bei Fragestellungen hinsichtlich der zellulären Untersuchungen sowie für zahlreiche anregende und kritische Hinweise. Den Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. S.
Ansorge danke ich für die gute Zusammenarbeit und die Diskussion theoretischer und praktischer Probleme sowie für das angenehme Arbeitsklima.
Herrn Dr. J. Faust danke ich für die Bereitstellung einiger von mir verwendeten Verbindungen. Ebenfalls danken möchte ich Herrn Dr. J. Rahfeld für die Bereitstellung der Dipeptidylpeptidase IV aus Schweineniere sowie für zahlreiche fachliche Dikussionen.
Außerdem danke ich Herrn Dr. T. Kähne für die Dipeptidylpeptidase IV aus humaner Niere sowie für die rekombinante humane Dipeptidylpeptidase IV.
Frau Dr. C. Mrestani-Klaus danke ich für die Durchführung zahlreicher NMR-spektroskopischer Experimente sowie für die Auswertung der Spektren. Frau Dr. A.
Schierhorn danke ich für die Durchführung der massenspektroskopischen Untersuchungen.
Ebenfalls danken möchte ich Herrn Dr. Y. Mrestani und Frau Dr. A. Stöckel-Maschek für die Anleitung bei einigen Experimenten und fachliche Dikussionen. Herrn PD Dr. W. Brandt danke ich für umfangreiche Molecular Modeling Experimente.
Weiterhin bedanke ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. K. Neubert für die gute Zusammenarbeit.