Androgenrezeptor (AR)

3.6.1.1.1 Immunhistochemische Darstellung Wie bereits beim Western Blot handel-te es sich bei dem zur Immundehandel-tektion des AR verwendehandel-ten Primärantikörper um den vom Kaninchen stammenden polyklonalen Antikörper „AR (N-20): sc-816“ (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Dieser wurde in einer Konzentration 2,0 x 10⁻⁵µg/µl eingesetzt.

Als Negativkontrolle diente das in gleicher Konzentration eingesetzte „Rabbit IgG“ der Firma Vector Laboratories.

Die Detektion des AR erfolgte an Bouin-fixierten Gewebeproben. Pro Tier wurden in Ab-hängigkeit der Hodengröße ein bis vier Schnitte mit dem AR-Antikörper inkubiert. Die Durchführung der Negativkontrolle verlief exemplarisch anhand je einer willkürlich ge-wählten Gewebeprobe pro Developmental Group der Versuchsgruppe „Gonazon^r“ sowie

den übrigen Versuchsgruppen „Kontrolle adult“, „Profact^r“ und „juvenil“.

In einem ersten Schritt wurden die Schnitte zweimal für je 10 min in Xylol deparaffiniert.

Es folgte deren je 5-minütige Rehydrierung in einer absteigenden Alkoholreihe aus 100, 95 und 70 %igem Ethanol mit abschließendem Wässern in Aqua bidest.

Zur Vorbereitung auf das Hitze-induzierte Antigen-Retrieval wurden die Proben 5 min in Citratpuffer gespült und anschließend in einen bereits bei 560 W im Mikrowellengerät erwärmten Citratpuffer überführt.

Es folgte das dreimalige, je 5-minütige Kochen der Proben in einem Mikrowellengerät bei 560 W. Das während des wiederholten Erhitzens verdunstete Flüssigkeitsvolumen wurde zwischen den einzelnen Kochschritten durch Citratpuffer ersetzt.

Anschließend kühlten die im warmen Puffer verbliebenen Gewebeschnitte für 20 min bei Raumtemperatur ab, bevor sie in den eigentlichen Tris-HCl-Puffer überführt und darin 5 min gewaschen wurden.

Zur Vermeidung möglicher unspezifischer Farbumsetzungen erfolgte das Blocken der en-dogenen Peroxidaseaktivität in einem abgedunkelten, 30-minütigen 3 %igen Wasserstoff-peroxid-Methanol-Bad.

Danach wurden die Schnitte erneut in Tris-HCl-Puffer gegeben und dreimal für je 5 min gewaschen.

Nun wurden die Objektträger einzeln dem Waschpuffer entnommen und die anhaften-de Flüssigkeit mithilfe von Präzisionswischtüchern entfernt, wobei ein Austrocknen anhaften-der Gewebeschnitte sicher vermieden wurde. Die Gewebeschnitte wurden mit dem Dako Pen umfahren, sodass eine Auftragsfläche für die nachfolgenden Inkubationslösungen geschaf-fen wurde, und mit dem Blockierungsserum überschichtet.

Die sich anschließende 30-minütige Inkubation der Proben mit einem Blockierungsserum (Normalserum) erfolgte in einer feuchten Kammer und diente der Sättigung eventuell vorhandener, gewebeeigener Bindungsstellen für den Zweitantikörper. Das Blockierungs-serum bestand aus einer auf 1x PBS-Puffer basierenden 1,43 %igen Bovines Serumalbu-min (BSA)-Lösung (1,43 % BSA-1x PBS-Puffer) mit 0,03 % Triton X-100, in welche das Ziegenserum (Vectastain^r ABC-Kit, Elite PK-6101 RABBIT IgG) entsprechend den Her-stellerangaben eingemischt worden war.

3.6. Immunhistochemische Untersuchungen Die Inkubation der mit dem Erstantikörper bzw. dem Kontrollserum überschichteten Ge-webeschnitte erfolgte in einer feuchten Kammer bei 4 °C über einen Zeitraum von 20 h.

Sowohl der Primärantikörper als auch das Kontrollserum waren hierzu mit Tris-HCl-Puffer auf eine Proteinkonzentration von 2 x 10⁻⁵µg/µl eingestellt worden.

Ein Überschuß an Primärantikörper und Kontrollserum wurde nach Ablauf der Inkubation durch dreimaliges, je 5-minütiges Waschen in Tris-HCl-Puffer von den Schnitten entfernt.

Als Zweitantikörper diente ein biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen IgG Antikörper (Vecta-stain^r ABC-Kit, Elite PK-6101 RABBIT IgG), welcher in Blockierungsserum nach Her-stellerangaben verdünnt worden war. Die Schnitte wurden mit der Zweitantikörper-Lösung überschichtet und für 50 min in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert.

Das Entfernen noch ungebundener Zweitantikörper erfolgte wiederum durch zweimaliges, je 5-minütiges und schließlich einmaliges 15-minütiges Waschen in Tris-HCl-Puffer.

Anschließend wurden die Schnitte in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 47 min mit dem Signal-verstärkenden Peroxidase-konjugierten Avidin-Biotin-Komplex (Vectastain^r ABC-Kit, Elite PK-6101 RABBIT IgG) überschichtet. Dieser war in Tris-HCl-Puffer den Herstellerangaben entsprechend vorbereitet worden.

Durch dreimaliges, je 5-minütiges Waschen in Tris-HCl-Puffer wurden die Proben erneut von überschüssigen, freien Avidin-Biotin-Komplexen befreit.

Die sich anschließende 30-minütige Inkubation der Gewebe erfolgte bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit dem nach Herstellerangaben in Tris-HCl-Puffer gelösten Farbsubstrat 3-Amino-9-Ethyl-Carbazol (AEC, AEC SUBSTRATE KIT FOR PEROXI-DASE SK4200) und diente der Visualisierung der stattgefundenen Antigen-Antikörper-Reaktion.

Das 5-minütige Spülen der Schnitte in fließendem Leitungswasser beendete die ablaufende Substratreaktion.

Die nachfolgende Gegenfärbung der Gewebe in einer wässrigen Hämatoxylin-Lösung (1:1) mit anschließendem 5-minütigem „Bläuen“ unter fließendem Leitungswasser diente der er-leichterten Identifizierung morphologischer Strukturen.

Abschließend wurden die Proben mithilfe von Kaisers Glyceringelatine unter Deckglas konserviert.

3.6.1.1.2 Auswertung Zur mikroskopischen Auswertung stand das bereits beschriebe-ne, mit der Digitalkamera Leica DC300 versehene Durchlichtmikroskop Leitz DMRM zur Verfügung. Nach der Überprüfung der Negativkontrollen wurden pro Tier 20 Tubuli semi-niferi contorti meanderförmig aufgesucht und in einer 400-fachen Vergrößerung beurteilt.

Die fotografische Dokumentation der Tubuli seminiferi contorti inklusive intratubulärer Zellen erfolgte bei einer 200-fachen Vergrößerung.

In einem ersten Schritt wurde, wie in Kapitel 3.4.1.1 für die DG A bis DG C und die DG D beschrieben, die morphologische Klassifizierung eines jeden Tubulus seminiferus contortus vorgenommen. Anschließend erfolgte mithilfe des Programms Leica Image Ma-nager IM1000 die Vermessung des kleinsten und größten rechtwinklig zueinander liegenden Durchmessers (d1, d2) pro Tubulus seminiferus contortus (vgl. Abbildung 3.2).

Abbildung 3.2: Vermessung eines Tubulus seminiferus contortus zur Feststellung des tu-bulären Flächeninhaltes

3.6. Immunhistochemische Untersuchungen Zur Berechnung des Flächeninhaltes eines tubulären Querschnittes fand die nachfolgende Formel Anwendung:

A=π^d₂^{1 d}₂² =π^d1₄^d2.

Anschließend wurde pro Tubulus seminiferus contortus die Anzahl AR-positiver und -negativer Sertolizellen (SZ) sowie deren Lokalisation zur Basalmembran festgestellt. Au-ßerdem erfolgte die subjektive Beurteilung und Zuordnung der Gesamtheit der in einem Tubulus seminiferus contortus befindlichen AR-positiven SZ zu den in Abbildung 3.3 dar-gestellten Färbeintensitäten FI 0 (fehlende), FI (1) (schwache), FI 1 (mittlere) und FI 2 (starke Anfärbung).

FI 0 FI (1) FI 1 FI 2

Abbildung 3.3: Färbeintensitäten (FI) der Sertolizellen (200 x; Ausschnitt);

[FI 0 (fehlende)/ FI (1) (schwache)/ FI 1 (mittlere)/ FI 2 (starke Anfärbbarkeit)]

Entsprechend erfolgte die quantitative Erfassung der Spermatogonien sowie deren Zuord-nung zu den in Abbildung 3.4 gezeigten Färbeintensitäten FI 0 bis FI 2.

FI 0 FI (1) FI 1 FI 2

Abbildung 3.4: Färbeintensitäten (FI) der Spermatogonien (200 x; Ausschnitt);

[FI 0 (fehlende)/ FI (1) (schwache)/ FI 1 (mittlere)/ FI 2 (starke Anfärbbarkeit)]

Die Auswertung und Dokumentation der intertubulären Leydigzellen (LZ) erfolgte eben-falls bei einer 400-fachen Vergrößerung. Hierzu wurden meanderförmig Gesichtsfelder auf-gesucht, die mindestens drei sicher zu identifizierende LZ aufwiesen.

Insgesamt wurden 100 LZ pro Tier einer einzelnen Bewertung ihrer Färbeintensität FI 0 bis FI 2 entsprechend der Abbildung 3.5 unterzogen.

FI 0 FI (1) FI 1 FI 2

Abbildung 3.5: Färbeintensitäten (FI) der Leydigzellen (Ausschnitt);

[FI 0 (fehlende)/ FI (1) (schwache)/ FI 1 (mittlere)/ FI 2 (starke Anfärbbarkeit)]

Anzumerken ist, dass für sämtliche Auswertungen ausschließlich sicher identifizierbare Zellen herangezogen wurden.

3.6. Immunhistochemische Untersuchungen