3.10.1 Adhäsion
Um die Adhäsion von CD4+T-Zellen an LSEC zu untersuchen, wurden Adhäsionsassays durchgeführt. LSEC (5x106/ml cDMEM) wurden über Nacht in An- oder Abwesenheit des OVA323-339-Peptids (5 µg/ml) bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert.
Ein Teil der LSEC wurde durch Zugabe von TNFα (10 ng/ml) und IFNγ (20 ng/ml) aktiviert. Am nächsten Tag wurden alle nicht-adhärenten Zellen sorgfältig weggewaschen und am Mikroskop überprüft, ob die LSEC einen Monolayer gebildet hatten. OVA-TCR-transgene und WT-CD4+T-Zellen wurden isoliert und mit Calcein AM (5 µg/ml) in einer Zelldichte von 1x107/ml cRPMI ohne FCS für 1 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit cRPMI gewaschen und für 2 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Dann wurden die toten Zellen
entfernt und jeweils 1x106 Calcein-markierte CD4+ T-Zellen auf die LSEC gegeben und für 1 h in cRPMI bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Danach wurden 2/3 des Mediums abgenommen und die Zellen zweimal für 10 min in 30 %iger Nycodenzlösung bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Dadurch lösten sich die nicht an das Endothel adhärierten Zellen vom Plattenboden und konnten mit dem Nycodenz entfernt werden. Es wurde, ohne den Plattenboden zu berühren, jeweils 2/3 des Mediums abgenommen. Nach zweimaligem Waschen der Platten mit PBS/BSA wurde die Fluoreszenzintensität von Calcein mit einem Spectrofluorometer gemessen Die detektierte Fluoreszenzintensität wurde ins Verhältnis zur Fluoreszenzintensität der Ausgangszellzahl gesetzt und als
% adhärierter CD4+ T-Zellen vom Input angegeben.
3.10.2 Transmigration
Kultivierung von LSEC auf Transwell®-Filtereinsätzen
Mittels Transmigrationsassays wurde die antigen- und chemokinabhängige transendotheliale Migration von CD4+T-Zellen durch einen LSEC-Monolayer untersucht. Dazu wurde das Transwell®-System, bestehend aus 24-Well-Platten mit Transwell®-Einsätzen, deren Boden aus einer Polycarbonatmembran mit 5 µm Porendurchmesser besteht, verwendet.
LSEC (5x106/ml cDMEM) wurden auf Transwell®-Filtereinsätzen bei 37°C und 5 % CO2
über Nacht kultiviert. Zur Überprüfung der Ausbildung des endothelialen Monolayer wurden die Transwell®-Einsätze am Ende des Versuchs für 2 h über 37 %iger Formaldehydlösung fixiert und für 10 min mit 2,6 %iger Giemsalösung gefärbt. Dann wurden die Membranen von den Einsätzen abgelöst und auf Objektträgern in Entellan® eingebettet. Die Ausbildung der Monolayer wurde am AxioImager Z1 Mikroskop überprüft.
Durchführung der Transmigrationsassays
CD4+T-Zellen wurden in einer Zelldichte von 5x106/ml im Migrationsmedium resuspendiert und für 2 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die auf den Transwell®-Einsätzen kultivierten LSEC gründlich mit PBS gewaschen, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Danach wurden 5x105 CD4+ T-Zellen in die obere Transwell®-Kammer gegeben und 600 µl Migrationsmedium in die untere Transwell® -Kammer pipettiert. Nach 90 min Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurden 500 µl Migrationsmedium aus der unteren Transwell®-Kammer entnommen und die Anzahl der transmigrierten Zellen am Durchflusszytometer bestimmt. Vor der Messung wurden die Zellen mit PI versetzt.
Bei der Untersuchung der antigenabhängigen Transmigration wurden die LSEC in An-oder Abwesenheit des OVA323-339-Peptids (5 µg/ml) kultiviert. Ein Teil der LSEC wurde durch Zugabe von TNFα (10 ng/ml) und IFNγ (20 ng/ml) aktiviert. Vor der Zugabe der OVA-TCR-transgenen oder WT-CD4+ T-Zellen wurden die LSEC gewaschen.
Bei der Analyse der chemokinabhängigen Transmigration wurden die LSEC vor der Zugabe der WT-CD4+ T-Zellen für 2 h mit den Chemokinen CXCL9, CXCL10 (beide 100 nM) oder CXCL12 (50 nM), zugegeben in die untere Transwell®-Kammer, bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach der Entfernung der Chemokine aus der unteren Transwell®-Kammer fanden die Transmigrationsassays wie beschrieben statt. Ein Teil der LSEC wurde vor der Chemokininkubation mit in die untere Transwell®-Kammer zugegebenem CPZ (30 µM) für 10 min bei 37°C und 5% CO2 behandelt und anschließend mit PBS gewaschen. In einem weiteren Ansatz wurden LSEC vor der Chemokininkubation mit den Enzymen Heparinase I oder Chondroitinase (beide 1 U/ml), zugegeben in die obere Transwell®-Kammer, für 2 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und vor den Transmigrationsassays gewaschen.
Quantifizierung der transmigrierten CD4+ T-Zellen
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden Fluoresbrite™ Microspheres als Zählbeads verwendet. Die Konzentration der Zählbeads wurde durch Zählung in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt und definierte Volumina zu den Proben gegeben. Es wurden 500 µl von 600 µl des Migrationsmediums aus der unteren Transwell®-Kammer entnommen und mit 10 µl Zählbeads versetzt. Anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen auf den Zellen mit einem anti-Fcγ-Rezeptor II/III Antikörper (20 µg/ml) geblockt und die Zellen mit einem anti-CD45RB und einem anti-CD4 Antikörper für 20 min bei 4°C inkubiert. Ohne Waschen der Zellen erfolgte die Analyse am Durchflusszytometer, wobei pro Probe 5000 Zählbeads gezählt wurden.
Aufgrund ihrer Größe und Fluoreszenz konnten die Zählbeads von den zu analysierenden Zellen unterschieden werden, was eine direkte Korrelation zwischen der Anzahl der Events im CD4-Gate und der Anzahl der Events im Zählbead-Gate ermöglichte (Abb. 5).
Abb. 5. Bestimmung der Zellzahl am Durchflusszytometer mittels Fluorescent™
Microspheres. Die zu analysierenden Zellen wurden über das FSC- und SSC-Signal (A) und die fluorochrommarkierten anti-CD4 und anti-CD45RB Antikörper (B) definiert. In (A) ist außerdem das Signal für die Fluoresbrite™ Microspheres dargestellt, deren Fluoreszenz im FL-1-Kanal detektiert wird. Sowohl um die Zellen als auch im die Zählbeads wurden Gates gelegt, um die Anzahl der in den Gates enthaltenen Events (Zahlen in den Dot Plots) zu ermitteln.
Die Anzahl transmigrierter CD4+ T-Zellen wurde wie folgt berechnet:
cCD4 = 6/5 x nCD4 / nZählbeads x cZählbeads
nCD4 = Anzahl der Events im CD4-Gate, ermittelt am Durchflusszytometer
nZählbeads = Anzahl der Events im Zählbead-Gate, ermittelt am Durchflusszytometer cZählbeads = Konzentration der eingesetzten Zählbeads, ermittelt in Zählkammer cCD4 = Konzentration transmigrierter CD4+ T-Zellen, ermittelt mittels Zählbeads
Die ermittelte Zellzahl wurde ins Verhältnis zur Ausgangszellzahl gesetzt und als
% transmigrierte CD4+ T-Zellen vom Input dargestellt.
3.10.3 In-vivo-Migration von CD4+ T-Zellen
Um die Migration von CD4+ T-Zellen in vivo zu untersuchen, wurden Homingassays durchgeführt. Dazu wurden die Zellen in einer Zelldichte von 2x107/ml cRPMI mit
51Chrom (20 µCi/ml) für 1 h bei 37°C radioaktiv markiert. Nach zweimaligem Waschen mit cRPMI wurden die Zellen für 1 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und anschließend die toten Zellen mittels eines 17 %igen Nycodenzgradienten entfernt.
Die radioaktiv markierten Zellen wurden in einer Zelldichte von 5x105-2x106/200 µl PBS intravenös (i.v.) in die Mäuse gespritzt. Die in bestimmten Organen, Blut und dem Restkörper enthaltene Radioaktivität wurde mittels eines WIZARD® Gamma-Counters gemessen. Dabei reflektierte der angebende Prozentsatz organspezifischer Radioaktivität im Verhältnis zur gesamten detektierten Radioaktivität den prozentualen Anteil von CD4+ T-Zellen, die in das entsprechende Organ migriert waren.