Analyse und Sequenzierung der Reisolate

Jeder H. pylori-Stamm besaß sein eigenes Bandenmuster bei der RAPD-PCR.

Anhand dieses Musters konnte die Abstammung der Reisolate den jeweiligen Infektionsstämmen zugeordnet werden. Auch unterschied sich jeder H. pylori-Stamm in der Sequenz des Gens, welches die 16S rDNA kodiert. Daher konnten die Isolate bei der Sequenzierung dieses Genabschnitts eindeutig zugeordnet werden. Mit Hilfe von molekularbiologischen Untersuchungsmethoden (RAPD-PCR und 16S rDNA Sequenzanalyse) wurde aus der gewonnenen bakteriellen DNA die Identifizierung über angewachsene H. pylori-Stämme nach der ersten Infektion erbracht. Dabei gelang es nicht immer, die Isolate mit den beiden molekularbiologischen Untersuchungsmethoden zu identifizieren. Zu Beginn des Infektionsversuches zwei Wochen nach der Infektion konnte das Isolat BO417 bei allen drei Tieren nachgewiesen werden. Tier 8156 wies eine Mischinfektion mit dem Stamm BO418 auf. Nach diesem Zeitpunkt gelang es nicht mehr, das Isolat BO418 zu isolieren.

Zwei Jahre nach der Infektion konnte Stamm BO417 bei den Tieren 7743 und 9050 nachgewiesen werden. Bei Tier 8156 gelang der Nachweis sogar über drei Jahre nach der Infektion (Tab. 8). Es konnten keine Bandenmuster oder Sequenzabweichungen ausgemacht werden, die auf einen Verlust oder Aufnahme von Genen oder Rekombination mit anderen Infektionsstämmen oder mit LGIS hindeuteten.

Tab. 8: Nachweis der Isolate der ersten Infektionsphase. Diese Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Christian Kraft, Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg durchgeführt. Die ersten zehn Monate nach der Infektion waren Gegenstand der Arbeit von KUNZ (2000). Die Untersuchungen dieser Arbeit begannen 19 Monate nach der Infektion.

2 wpi BO417 BO417 /BO418 BO417

5 mpi - BO417

-10 mpi BO417 BO417 BO417

19 mpi BO417 BO417 BO417

24 mpi BO417 - BO417

36 mpi - BO417

-

Isolations-zeitpunkt Tier 7743 Tier 8156 Tier 9050

1 1, 2

1, 2

2

1 1 1, 2

1 1, 2

1, 2 1, 2

1, 2 1

1, 2

1 Genanalyse mit der RAPD-PCR, ² Genanalyse mit der 16S rDNA Sequenzanalyse, BO417 bzw. BO418 = H. pylori-Isolat, - = kein Isolatnachweis

Abb. 4: RAPD-PCR der Reisolate aus Rhesusaffen mit Primer AP1254. Die Infektionsstämme BO417 und BO418 zeigen ein deutlich voneinander abweichendes Bandenmuster. Mit Ausnahme des Isolats in Tier 8156 zwei Wochen nach Infektion, indem die Bandenmuster beider Infektionsstämme vorhanden sind (Mischinfektion), entsprechen alle weiteren Reisolate ausschließlich dem Bandenmuster des Stammes BO417. BO417, BO418 = Infektionsstämme; 7743, 8156, 9050 = Tiernummern; wpi = Wochen nach Infektion; mpi = Monate nach Infektion. Aus der Dissertation KRAFT (2004).

Zur Stammidentifizierung der gewonnenen humanen Isolate diente die Multilokus-Sequenz-Typisierung (Kap. 3.1.17.5). Die Analyse der sequenzierten Isolate aus Menschen hat gezeigt, dass das am häufigsten von Rekombination oder Mutation betroffene Gen aller Infektionsstämme das ureI-Gen war (ACHTMAN et al. 1999).

Jeden Infektionsstamm konnte man aufgrund der unterschiedlichen urel-Sequenz eindeutig identifizieren. Daher wurde dieses Gen von allen Isolaten der Superinfektion sequenziert. Alle Infektionsstämme trugen ein eigenes Allel dieses Gens, so konnten die Reisolate den Infektionsstämmen eindeutig zugeordnet und eventuell auftretende Rekombinationsereignisse festgestellt werden. Es genügte, sich bei der Identifizierung der Reisolate auf die ausschließliche Sequenzierung des urel-Gens zu verlassen, weil diese Analyse eine klare Aussage treffen konnte, ob die

inokulierten Stämme mit den Isolaten aus den Magenbiopsien übereinstimmten. Mit Hilfe der Bandenmuster der RAPD-PCR (nur Primer AP1254, alle Isolate bis 4 wpsi) bzw. der urel-Sequenzierung wurde der Nachweis über angewachsene H. pylori-Stämme nach der Superinfektion erbracht. So konnten nach der Superinfektion nur noch die H. pylori-Stämme CC28C und MM1303 festgestellt werden. Alle anderen inokulierten Stämme (BO417, BO418, BO238 und RE7006) wurden nicht mehr identifiziert. Wie schon im ersten Infektionsmodell war eine Reisolierung aus Biopsiematerial nicht zu allen Zeitpunkten möglich. Nach einer anfänglichen Etablierungsphase wurde es schwer, Reisolate nach vier bis acht Monaten zu erhalten. 10 Monate nach der Infektion wuchs die Zahl der Reisolate jedoch wieder an. Im Einzelnen wurden folgende Befunde erhoben.

Nach der Superinfektion war bei Tier 7743 ausschließlich der H. pylori-Stamm CC28c nachzuweisen. Bis vier Wochen nach der Superinfektion konnte das Isolat nachgewiesen werden. Aus Tier 8156 konnten nach drei Tagen ebenfalls Isolate des CC28c-Stammes isoliert werden. Die Isolate, die nach einer Woche der Superinfektion isoliert wurden, zeigten eine Mischinfektion mit den Stämmen MM1303 und CC28c. Über den Zeitraum eines Jahres konnten nur noch Isolate des Stammes MM1303 identifiziert werden. Dann konnte 57 Wochen nach der Superinfektion Stamm CC28c wieder nachgewiesen werden. Die Isolate aus Tier 9050 zeigten nahezu das gleiche Bild wie bei Tier 8156. Eine Mischinfektion der Stämme MM1303 und CC28c konnte in der ersten und in der vierten Woche nach der Superinfektion festgestellt werden. Wiederum verging ein Jahr regelmäßiger molekularbiologischer Untersuchungen, ohne dass ein Nachweis von Isolaten gelang. Nach Ablauf dieser Zeitspanne konnte der Stamm MM1303 erneut isoliert werden (Tab. 9). Keine der erhaltenen ureI-Sequenzen wies eine Rekombination oder Punktmutation trotz zumindest zeitweiliger Co-Kolonisierung der Isolate CC28c und MM1303 auf. Alle Sequenzen waren identisch mit einem der Infektionsstämme.

Es konnte ebenfalls keine Interspeziesrekombination mit den LGIS gefunden werden.

Bei Untersuchungen des Kontrolltieres 9048 konnten über den gesamten

Untersuchungszeitraum nie Helicobacter-Stämme kulturell nachgewiesen werden, sodass auch keine molekularbiologischen Untersuchungen dahingehend erfolgten.

Tab. 9: Nachweis der Isolate der Superinfektion. Diese Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Christian Kraft, Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg durchgeführt.

3 dpsi - CC28c

-1 wpsi CC28c CC28c /MM1303 CC28c /MM1303

2 wpsi CC28c MM1303 MM1303

4 wpsi CC28c MM1303 CC28c /MM1303

16 wpsi - MM1303

Isolations-zeitpunkt Tier 7743 Tier 8156

1, 2 1, 2

1 Genanalyse mit der RAPD-PCR, ² urel-Sequenzierung, CC28c bzw. MM1303 = H.

pylori-Isolat, - = kein Isolatnachweis