3. ERGEBNISSE
3.3 Analyse der Lokalisation und Interaktion der Fusionsproteine in Protoplasten
3.3.4 Analyse der Protein-Protein-Interaktion mittels FRET in Protoplasten und in A. thaliana
Die Koexpression von YN-BHLH2 und YC-BHLH2 führte auch in At7-Protoplasten, zu einer Rekonstitution der Fluoreszenz (Abb. 3-30, C). Das Homodimer akkumulierte dabei ringförmig am bzw. um den Zellkern. Die Lokalisation des BHLH2-MYB75 Komplexes konnte also ebenfalls in den lebenden At7-Zellen detektiert werden, ebenso wie die Lokalisation des BHLH2-Homodimers. Die Koexpression von YN-MYB75 und YC-MYB75 führte auch in At7-Protoplasten zu keiner Rekonstitution der Fluoreszenz. In keinem transfizierten Protoplasten konnte eine YFP-Fluoreszenz detektiert werden, weshalb davon auszugehen ist, dass MYB75 nicht in der Lage ist, Homodimere zu bilden.
3.3.4 Analyse der Protein-Protein-Interaktion mittels FRET in
BHLH42-Cherry
GFP-MYB75
GFP
A B
C
12 µm
BHLH42-Cherry
GFP-MYB75
GFP
A B
C
BHLH42-Cherry
GFP-MYB75
GFP
A B
C
12 µm 12 µm
Abbildung 3-31: Die subzelluläre Lokalisation der Fusionsproteine BHLH42-Cherry und GFP-MYB75 in At7-Protoplasten.
At7-Protoplasten wurden transient mit den Konstrukten ProMYB75::GFP:MYB75 bzw.
ProBHLH42::BHLH42:Cherry transfiziert, um die Lokalisation der grünen Fluoreszenz von GFP bzw.
der roten Fluoreszenz von Cherry mit Hilfe der konfokalen Imaging-Mikroskopie zu analysieren.
Repräsentative Aufnahmen zeigen (A) BHLH42-Cherry; (B) GFP-MYB75; (C) GFP (als Positivkontrolle).
Zunächst wurden die Fusionsproteine GFP-MYB75 und BHLH42-Cherry auf ihre Interaktion in At7-Protoplasten getestet, wenn sie unter der Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotors exprimiert wurden. Dabei zeigte sich, dass eine starke Akkumulation der Fluoreszenzproteine im Kern der transfizierten Protoplasten auftrat. In Abbildung 3-32 ist ein Ausschnitt des Zellkerns des Protoplasten gezeigt. Wurde GFP mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt, konnte die GFP-Fluoreszenz mit 500-550 nm detektiert werden (Abb. 3-32, B). Fand eine Anregung mit 488 nm statt, konnte Cherry-Fluoreszenz bei 600-650 nm (durch Separation der Detektionskanäle) detektiert werden (Abb. 3-32, C).
Dort, wo sich die beiden Fluorophore in einem Bereich zwischen 2-10 nm befanden, konnte das GFP-Fluorophor (Donor) seine Anregungsenergie durch den Energietransfer strahlungslos über Dipol-Dipol Kopplung im Nahfeld auf das Akzeptormolekül (Cherry) übertragen (FÖRSTER-Transfer). Hier musste also ein Energieübertrag von GFP auf Cherry stattgefunden haben, da ansonsten bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm keine Detektion der Cherry-Fluoreszenz stattfinden konnte.
GFP-MYB75 + BHLH42-Cherry
A
C B
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry)
12 µm
GFP-MYB75 + BHLH42-Cherry
A
C B
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry) GFP-MYB75 + BHLH42-Cherry
A
C B
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry)
12 µm 12 µm
Abbildung 3-32: Die subzelluläre Interaktion der Fusionsproteine BHLH42-Cherry und GFP-MYB75 in At7-Protoplasten.
At7-Protoplasten wurden transient mit 35S::BHLH42:Cherry und 35S::GFP:MYB75 transfiziert, um die Lokalisation der Interaktion mittels FRET zu analysieren. (A) Akkumulation von BHLH42-Cherry und GFP-MYB75 im Zellkern des Protoplasten; (B) GFP-Fluoreszenz detektiert durch Anregung mit 488 nm und Detektion mit 500-550 nm; (C) Cherry-Fluoreszenz detektiert durch Anregung mit 488 nm und Detektion mit 600-650 nm (Energieübertrag hat stattgefunden).
Da die Interaktion unter möglichst natürlichen Bedingungen untersucht werden sollte, wurden Fusionsproteine eingesetzt, die unter der Kontrolle ihrer jeweiligen nativen Promotoren exprimiert wurden. Die Fusionsproteine GFP-MYB75 und BHLH42-Cherry wurden auf ihre Interaktion in At7-Protoplasten getestet, wenn sie unter der Kontrolle des nativen Promotors exprimiert wurden. Dabei zeigte sich, dass eine starke Akkumulation der Fluoreszenzproteine im bzw. um den Kern der transfizierten Protoplasten auftrat (Abb. 3-33, A). Zur besseren Orientierung ist der transfizierte Protoplast in einer Hellfeldaufnahme gezeigt (Abb. 3-33, D). Wurde der Protoplast mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt, konnte eine GFP-Fluoreszenz bei 500-550 nm detektiert werden (Abb. 3-33, B). Durch die Möglichkeit der Separation der Detektionskanäle konnte bei einer Anregung von 488 nm ebenfalls eine Detektion bei einer Wellenlänge von 600-650 nm (Cherry) stattfinden (Abb. 3-33, C). Auch unter nativen Expressionsbedingungen konnte ein Energieübertrag von GFP auf Cherry gemessen werden. Dies konnte nur ermöglicht werden, da sich die beiden Fluoreszenzproteine, auch wenn sie unter der Kontrolle des jeweiligen endogenen Promotors exprimiert wurden, in einer geringen Nähe zueinander befanden.
A
B C
D
GFP-MYB75 + BHLH42-Cherry
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry)
12 µm
A
B C
D
GFP-MYB75 + BHLH42-Cherry
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry)
12 µm 12 µm
Abbildung 3-33: Subzelluläre Lokalisation der Interaktion der Fusionsproteine BHLH42-Cherry und GFP-MYB75 in At7-Protoplasten.
At7-Protoplasten wurden transient mit den Konstrukten ProBHLH42::BHLH42:Cherry und ProMYB75::GFP:MYB75 transfiziert um die Lokalisation der Interaktion mittels FRET zu analysieren.
(A) Akkumulation von BHLH42-Cherry und MYB75 im Zellkern des Protoplasten; (B) GFP-Fluoreszenz detektiert durch Anregung mit 488 nm und Detektion mit 500-550 nm; (C) Cherry-Fluoreszenz detektiert durch Anregung mit 488 nm und Detektion mit 600-650 nm (Energieübertrag hat stattgefunden). (D) Hellfeld-Aufnahme des Protoplasten.
Die Fusionsproteine GFP-MYB75 und BHLH2-Cherry wurden ebenfalls auf ihre Interaktion in At7-Protoplasten getestet, wenn sie unter der Kontrolle der nativen Promotoren exprimiert wurden. Dabei zeigte sich, dass eine Akkumulation der Fluoreszenzproteine in vesikelähnlichen Strukturen um den Kern und im Cytoplasma der transfizierten Protoplasten auftrat (Abb. 3-34, A). Zur besseren Orientierung ist der transfizierte Protoplast in einer Hellfeldaufnahme gezeigt (Abb. 3-34, D). Wurde der Protoplast mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt, konnte eine GFP-Fluoreszenz bei 500-550 nm an den gleichen Stellen detektiert werden (Abb. 3-34, B).Erfolgte bei einer Anregung von 488 nm eine Detektion der Cherry-Fluoreszenz konnte von einem Energieübertrag ausgegangen werden (Abb. 3-34, C). Die Interaktion der beiden Fusionsproteine fand verstärkt in der Nähe des Zellkerns statt, war aber ebenfalls in vesikelähnlichen Strukturen im Cytoplasma zu finden (Abb. 3-34, C).
GFP-MYB75 + BHLH2-Cherry
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry)
A D
C B
12 µm
GFP-MYB75 + BHLH2-Cherry
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry)
A D
C B
GFP-MYB75 + BHLH2-Cherry
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 500-550 nm (GFP)
Anregung: 488 nm (GFP) Detektion: 600-650 nm (Cherry)
A D
C B
12 µm 12 µm
Abbildung 3-34: Subzelluläre Lokalisation der Interaktion der Fusionsproteine BHLH2-Cherry und GFP-MYB75 in At7-Protoplasten.
At7-Protoplasten wurden transient mit den Konstrukten ProBHLH2::BHLH2:Cherry und ProMYB75::GFP:MYB75 transfiziert, um die Lokalisation der Interaktion mittels FRET zu analysieren.
(A) Akkumulation von BHLH2-Cherry und GFP-MYB75 um den Zellkern und im Cytoplasma des Protoplasten; (B) GFP-Fluoreszenz detektiert durch Anregung mit 488 nm und Detektion mit 500-550 nm; (C) Cherry-Fluoreszenz detektiert durch Anregung mit 488 nm und Detektion mit 600-650 nm (Energieübertrag hat stattgefunden). (D) Hellfeld-Aufnahme des Protoplasten.
Um zu überprüfen, ob diese Fusionsproteine ebenfalls in Pflanzen miteinander interagieren, wurden die doppelt komplementierten myb75 bhlh42 Doppelmutanten (vgl. 3.2.2) zur Analyse herangezogen. Analog zu den Lokalisationsstudien wurden die Keimlinge auf Filterpapier mit Norfluorazon und Saccharose angezogen, um die Expression der Fusionsproteine GFP-MYB75 und BHLH42-Cherry unter der Kontrolle des nativen Promotors zu stimulieren. Wie in Protoplasten-Analysen wurde der Energietransfer in pflanzlichen Hypokotyl- und Keimblattzellen gemessen (Abb. 3-35).
Sowohl in den Zellkernen der pflanzlichen Keimblatt- als auch Hypokotylzellen konnte eine klare Cherry-Fluoreszenz nach Anregung mit einer Wellenlänge von 488 nm gemessen werden (Abb. 3-35, D-F). In den pflanzlichen Zellen akkumulieren die Fluoreszenzproteine so dicht beieinander, dass demnach ein Energietransfer von GFP nach Cherry ermöglicht wurde.
A B C
D E F
Anregung:
488 nm (GFP) Detektion:
530 nm (GFP)
Anregung:
488 nm (GFP) Detektion:
630 nm (Cherry)
(HK) (HK)
(KB)
Keimblatt (KB)
(HK)
Hypokotyl (HK)
A B C
D E F
Anregung:
488 nm (GFP) Detektion:
530 nm (GFP)
Anregung:
488 nm (GFP) Detektion:
630 nm (Cherry)
(HK) (HK)
(KB)
Keimblatt (KB)
(HK)
Hypokotyl (HK)
Abbildung 3-35: In planta Lokalisation der Interaktion der Fusionsproteine BHLH42-Cherry und GFP-MYB75 in transgenen A. thaliana Keimlingen.
Die A. thaliana Keimlinge wurden stabil mit den Konstrukten ProBHLH42::BHLH42:Cherry und ProMYB75::GFP:MYB75 transformiert, um die Lokalisation der Interaktion mittels FRET zu analysieren. (A-C) Detektion der GFP-Fluoreszenz durch die Anregung mit 488 nm; (D-F) Detektion der Cherry-Fluoreszenz durch Anregung mit 488 nm und Detektion mit 600-650 nm (Energieübertrag hat stattgefunden).
Um kontrollieren zu können, dass der Energieübertag von dem Donormolekül (GFP) auf das Akzeptormolekül (Cherry) tatsächlich stattgefunden hat, wurde ein Bleichversuch durchgeführt. Der Energieübertrag kann nur ermöglicht werden, wenn das Cherry-Fluorophor funktional ist. Durch den Übertrag von Energie wird die Fluoreszenz des Donormoleküls schwächer. Ist das Cherry-Fluorophor nach dem Bleichen nicht mehr funktional, kann kein Energieübertrag mehr stattfinden und das Donor-Molekül müsste stärker fluoreszieren. Abbildung 3-36 zeigt eine Zelle des Hypokotylgewebes in transgenen A. thaliana myb75 bhlh42 Doppelmutanten, die mit den Konstrukten ProMYB75::GFP:MYB75 und ProBHLH42::BHLH42:Cherry transformiert wurden.
In der pflanzlichen Zelle konnte vor dem Bleichen des Cherry-Fluorophors GFP und Cherry detektiert werden (Abb. 3-36, A und C). Wurden die Cherry-Fluorophore für wenige Minuten mit dem Laser stark gebleicht, war anschließend keine Cherry-Fluoreszenz mehr detektierbar (Abb. 3-36, B). Das Cherry-Fluoreszenzprotein war demnach nicht mehr funktional. Im Vergleich dazu wurde die Fluoreszenz von GFP nach dem Bleichen des Akzeptormoleküls gemessen (Abb. 3-36, D).
Cherry, vor Bleichen Cherry, nach Bleichen
GFP, vor Bleichen GFP, nach Bleichen
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,1 x104 Hz
A B
C D
Cherry, vor Bleichen Cherry, nach Bleichen
GFP, vor Bleichen GFP, nach Bleichen
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,1 x104 Hz
A B
C D
Abbildung 3-36: Kontrolle der Energieübertragung (FRET) von GFP auf Cherry in transgenen A. thaliana Keimlingen.
Die A. thaliana Keimlinge wurden stabil mit den Konstrukten ProMYB75::GFP:MYB75 und ProBHLH42::BHLH42:Cherry transformiert, um die Energieübertragung mittels FRET zu analysieren.
(A-B) Detektion der Cherry-Fluoreszenz (Akzeptor) vor und nach dem Bleichen; (C-D) Detektion der GFP-Fluoreszenz (Donor) vor und nach dem Bleichen. Die Skala zeigt farblich die Stärke der Fluoreszenz an (0,2-1,1 x 104 Hz).
Es war zu erkennen, dass die Fluoreszenz der GFP-Moleküle (Donor) nach dem Bleichen der Akzeptormoleküle (Cherry) signifikant stärker detektiert werden konnte als vor dem Bleichen des Akzeptors. Diese Kontrolle zeigt, dass ein Energieübertrag stattgefunden haben muss, der nach dem Verlust der Funktionalität der Cherry-Moleküle nicht mehr möglich war. Dadurch, dass GFP nach dem Bleichen von Cherry keinen Energieübertrag mehr vollziehen konnte, wurde eine stärkere GFP-Fluoreszenz gemessen.
Durch diese Kontrollen konnte gezeigt werden, dass sowohl in Protoplasten als auch in Pflanzen Energietransfer zwischen den fluoreszierenden Proteinen stattgefunden hat. Das bedeutet, dass sich die Fusionsproteine GFP-MYB75 und BHLH42-Cherry in den Zellen in dichter räumlicher Nähe zueinander befunden haben.