Analyse der DEREG- Maus

Parallel zu unserem negativen Sequenzierungsergebnis erhielten wir von der Arbeitsgruppe von Tim Sparwasser (TU München) ein Kooperationsangebot, um mit einer dort generierten Reportermaus zu arbeiten. Diese Maus ist ebenfalls eine BAC- transgene Maus, die im ersten Exon des foxp3- Lokus die kodierende Region des eGFP sowie den kodierenden Bereich des Diphtheria Toxin Rezeptors (DTR) enthält [37] . Der DTR bietet einem die Möglichkeit, Foxp3- exprimierende Zellen gezielt durch die Gabe von Diphtheria- Toxin (DT) zu deletieren. Die Maus wurde DEREG- Maus (depletion of regulatory Tcells) genannt.

4.1.5.1 Analyse der Foxp3

T- Zellen in der DEREG- Maus

Als erstes wurde überprüft, ob die DEREG- Maus einen normalen Phänotyp einer C57BL/6 Maus zeigt, da der BAC durch seine zufällige Integration in das Genom der Maus ein wichtiges Gen der Maus deletiert haben kann. Es wurden weder im Verhalten noch in der Zucht Auffälligkeiten entdeckt, die DEREG- Maus agiert wie eine WT C57BL/6 Maus. Erste Versuche, dargestellt in Abbildung 4-9, wurden durchgeführt, um zu überprüfen, ob die Foxp3- Expression mit der GFP- Expression korreliert. Dieses war notwendig, da der BAC im Genom der Maus zufällig integriert und somit unter die Kontrolle eines starken Promoters bzw. Silencer geraten sein kann. In diesem Fall würde die GFP- Expression stärker bzw. schwächer als die Foxp3- Expression ausfallen.

Abbildung 14: Analyse der Foxp3⁺ T- Zellen

DEREG Tieren wurden Milz und mLK entnommen und auf die Moleküle CD4 und Foxp3 gefärbt; dargestellt sind alle Lymphozyten in Bezug auf ihre CD4, GFP und Foxp3 Färbung; umkreiste T- Zellen sind die jeweils GFP bzw. Foxp3⁺ T- Zellen oder GFP/Foxp3 doppel positiven; Prozentangabe entspricht dem Vorkommen der Foxp3⁺ und GFP⁺ T- Zellen in den gesamten Lymphozyten des entsprechenden Organs.

der GFP⁺ und GFP^- T- Zellen schwerer ist. Die beiden Populationen gehen im Gegensatz zur Foxp3- Färbung in einander über und dadurch ist die genaue Prozentzahl schwer bestimmbar und kann Schwankungen aufzeigen. Bei der Darstellung der Foxp3⁺ gegen die GFP⁺ T- Zellen kann man aber erkennen, dass alle GFP⁺ T- Zellen auch Foxp3⁺ sind.Weiterhin wurden noch die pLK, Peyers Patches, IELs und der Thymus analysiert. Die gleichen Beobachtungen wie in Milz und mLKs konnten auch in diesen Organen gemacht werden (Daten nicht gezeigt).

4.1.5.2 Depletion der Foxp3

T- Zellen

Nachdem gezeigt worden war, dass das Expressionsmuster unseren Erwartungen entsprach, wurde die Funktionalität des DTRs analysiert. In diesem Abschnitt wurde die Depletion der Foxp3⁺ T- Zellen mittels Diphtheria- Toxin (DT) überprüft. Hierfür wurde DEREG- Mäusen an zwei aufeinander folgenden Tagen, Diphtheria Toxin i.p. gespritzt. Am Tag 1 nach DT- Gabe wurden Milz, mLK, pLK, PP, IEL und Thymus der Mäuse auf die Expression von GFP und Foxp3 analysiert.

Abbildung 15: Depletion der Foxp3⁺ bzw. GFP⁺ T- Zellen in DEREG Mäusen

Den Mäusen wurde alle 24 h 1µg Diphtheria Toxin (DT) i.p. gespritzt. Nach zweimaliger DT- Gabe wurden die Milzen der Mäuse entnommen und die Foxp3- und GFP- Expression untersucht; in den umrandeten Bereichen liegen die GFP- bzw. Foxp3- positiven T- Zellen; Prozentangabe entspricht dem Vorkommen der Foxp3⁺- und GFP⁺ T- Zellen in den gesamten Lymphozyten des entsprechenden Organs.

Nach der Diphtheria- Toxin Gabe wurden, wie in Abbildung 4-10 für die Milz dargestellt, die GFP- sowie Foxp3- positiven T- Zellen depletiert. Auffällig ist, dass ein Teil der Foxp3⁺ T- Zellen nicht mit depletiert wurden. Dieser Anteil der Foxp3⁺ T- Zellen wurde im Gegensatz zu allen GFP⁺ T- Zellen durch die Gabe von DT nicht depletiert. Bei allen überprüften Organen war die gleiche Entwicklung zu beobachten.

4.1.5.3 Vergleich der Diphtheria- Toxine von Merck und Sigma zur Depletion der Foxp3

T- Zellen

Im weiteren Verlauf der Arbeit trat eine Diskrepanz zwischen unseren Analysen der DEREG- Maus und den Analysen einer weiteren existierenden BAC- transgenen Maus auf, welche ebenfalls unter der Kontrolle des Foxp3- Promoters den DTR exprimiert. Diese Diskrepanz zeigte sich bei dem Phänotyp der DEREG- Maus nach DT- Gabe [37] ; [36] .

Bei einer näheren Überprüfung des Depletionsprotokolls mit unserem eigenen Protokoll [37] fielen als wichtigste Unterschiede die Herstellerfirma des DTs sowie das Schema der Verabreichung des DTs (jeden zweiten Tag im Gegensatz zu jedem Tag) auf. In dem in Abbildung 4-11 dargestellten Versuch wurden das DT von Merck und Sigma miteinander verglichen. C57BL/6 Kontrolltieren und DEREG- Tieren wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen jeden zweiten Tag genau nach dem Protokoll von Kim et al. [36] DT verabreicht. Zunächst wurde der optische Zustand der Mäuse (Fell, körperliche Verfassung) und ihre Gewichtsentwicklung kontrolliert.

Abbildung 16: Gewichtsabnahme der Mäuse bei Diphtheria Toxin- Behandlung

C57BL/6 und DEREG- Tieren wurden jeden zweiten Tag 1µg DT i.p. gespritzt; an diesen Tagen wurde auch das Gewicht der Mäuse überprüft; der Versuch wurde an Tag 14 abgebrochen, da die Kontroll- und DEREG- Tiere, welche mit Sigma DT behandelt worden waren, zu große Gewichtsabnahmen aufwiesen.

Nach 14 Tagen wurde der Versuch abgebrochen, weil die Mäuse, welche das DT von Sigma bekommen hatten, einen Gewichtsverlustes von mehr als 20% aufwiesen (vgl. Abbildung 4-11).

Dieser Gewichtsverlust konnte ausschließlich bei den Tieren, welche mit Sigma DT behandelt worden waren, beobachtet werden, interessanterweise auch bei den Kontrolltieren, bei denen keine Depletion der Tregs erfolgte. Die Tiere, welche mit Merck DT behandelt worden waren, zeigten diese massive Gewichtsabnahme nicht. Die Milzen und Lks, der mit Sigma DT behandelten Tiere waren im

Vergleich zu den mit Merck DT behandelten Tieren leicht vergrößert (Daten nicht gezeigt). Eine spätere histologische Untersuchung zeigte weiterhin, dass bei allen DEREG- Tieren im Gegensatz zu den Kontrolltieren ein beginnender „scurfy“- Phänotyp feststellbar ist, was den Schluss zulässt, dass beide DTs in Bezug auf die Depletion der Tregs wirksam waren.