Analyse der Proteinexpression

Die Expression des phosphorylierten TGF-β Rezeptor RII (Tyr 424), E-Cadherin und β-Aktin wurde in den Zelllinien HaCaT, UMSCC-1, UM-SCC-3 und UM-SCC-22B nach Zugabe von exogenem TGF-β1 zu definierten Inkubationszeiten untersucht (Tabelle 3). Als Ladungskontrolle diente β-Tubulin. Hierfür wurde eine definierte Zellzahl jeder Zelllinie auf acht Zellkulturschalen (6 cm) ausgesät und beschriftet. Um zu gewährleisten, dass zum Zeitpunkt der Proteinernte genug Material vorhanden ist, wurden die Zelllinien aufgrund ihrer erfahrungsgemäß unterschiedlichen Zellteilungsrate folgendermaßen ausgesät HaCaT>500x10³/Well, UM-SCC-1>500x10³/Well, UM-SCC-3>500x10³/Well und UM-SCC-22B>600x10³/Well und unter Standardbedingungen (5% CO2 bei 37 °C) für 24 Stunden kultiviert. Am darauffolgenden Tag erfolgte ein vollständiger Mediumwechsel und in die mit t=72 h Stunden markierten Schalen wurde TGF-β1 in einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugegeben. Als Kontrolle diente die Trägersubstanz von TGF-β1 (4 mmol/l HCL), welche in gleicher Menge (1,5 µl) in die entsprechende Kontrollschale pipettiert wurde. Nach Schwenken der Platte zur Mischung wurde die Inkubation fortgesetzt. Am nachfolgenden Tag wurden die mit t=48 h markierten Schalen entsprechend entweder mit 1,5 µl TGF-β1 oder mit der Kontrollsubstanz versetzt. Nach weiteren 24 h erfolgte die gleiche Behandlung der mit t=24 h markierten Wells und 24 Stunden später die Zugabe in die mit t=0 h markierten Schalen und die sofortige Beendigung des Versuchs.

Tabelle 3. TGF-β1 Inkubation Schema

Zeit (h) 72 72 48 48 24 24 0 0

TGF-β1 (10 ng/ml) + - + - + - - -

Kontrolle (4 mmol/l HCl) - + - + - + - +

Proben Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

2.2.5.1 Proteinextraktion

Zum sofortigen Reaktionsstopp und zur Gewinnung des Zelllysats, wurde das Nährmedium entfernt, der Zellrasen mit 1 ml PBS gespült und anschließend mit 100 µl Protein Lysepuffer (20 mmol/l Tris/HCl pH 7,5, 137 mmol/l NaCl, 10% Glycerol, 1% NP40 und 2 mmol/l EDTA, mit 100 µl/ml Proteaseinhibitor Cocktail 1 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) und 50 µl/ml Phosphataseinhibitor Cocktail 2 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)) versetzt. Die Auflösung der Zellmembran mittels Lysepuffer ist notwendig, um Proteine freizusetzen, die im weiteren Verfahren gemessen werden sollen.

Phosphatase- und Protease-Inhibitoren verhindern eine weiter voranschreitende Degradierung und Dephosphorylierung, welche das Ergebnis beeinflussen würden. Die Ablösung der Zellen erfolgte mechanisch mittels eines Zell-Schabers. Um eine ausreichende Durchmischung der Substanzen zu gewährleisten, wurde das Lysat in ein Reaktionsgefäß überführt und für 30 min bei 4 °C auf einem Suspensionsmixer durchgerührt und anschließend für 10 min bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand mit den enthaltenen Proteinen wurde in ein weiteres Eppendorf Gefäß überführt. Nun erfolgte die quantitative Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Photometrie nach der Bradford Methode, wonach die Zell Lysate zur Lagerung bei -80 °C eingelagert wurden.

2.2.5.2 Messung der Proteinkonzentration nach der Bradford Methode

Zur Vergleichbarkeit der Proteinmengen erfolgte eine Konzentrationsbestimmung der Proteine in Gesamt Zelllysaten der jeweiligen Zelllinien. Hierfür wurde die Methode nach Bradford eingesetzt, wonach Proteine konzentrationsabhängig einen Farbstoff binden. Die proportionale Farbveränderung und damit Änderung der Absorption wird mittels eines Photometers bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen. Zur Proteinbestimmung wurde das Bio-Rad Protein-Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) entsprechend der Herstellerangaben eingesetzt. BSA diente als Standard zur Herstellung einer Proteinstandardkurve (Tabelle 4).

Tabelle 4. Pipettierschema für die Erstellung einer Proteinstandardkurve Leerwert Standard

1:2 Standard

1:4 Standard

1:6 Standard

1:8 Standard

1:10 Probe

Bio Rad 1:5 1 ml 1 ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 ml

BSA - 1µl 2µl 3µl 4µl 5µl -

Lysispuffer 3µl 3µl 3µl 3µl 3 µl 3µl -

Probenextrakt - - - - - - 3µl

2.2.5.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Nach Bestimmung der Proteinkonzentrationen erfolgte mittels SDS-PAGE in einem elektrischen Feld die Auftrennung der Proteine entsprechend ihrer Molekülmasse. Durch Zugabe des Detergenz SDS werden die Proteine zunächst einheitlich negativ geladen, damit die Auftrennung nicht von unterschiedlichen Ladungen beeinflusst wird, sondern lediglich von der Größe des Proteins abhängig ist. Der im Ladepuffer enthaltene Farbstoff Bromphenolblau (Molekulargewicht=0,67 kDa), macht die Lauffront der Proteine sichtbar. Nun werden die Proteine in ein zuvor polymerisiertes SDS-Polyacrylamid Gel aufgetragen und an ein elektrisches Feld angeschlossen. Die Proteine wandern aufgrund ihrer Negativladung durch das Gel Richtung Anode. Das Gel wirkt dabei wie ein Sieb, bei dem kleinere Proteine schneller wandern, große Proteine hingegen, abhängig von ihrem Molekulargewicht, langsamer (Abbildung 7A). In dieser Arbeit wurde ein diskontinuierliches Gel verwendet, bestehend aus einem Sammel- und Trenngel. Im Sammelgel liegt ein pH-Wert von 6,8 zur Konzentrierung der Proteinproben und im Trenngel ein basischer pH-Wert von 8,8 vor, was einen Stapelungseffekt der Proteine an der Grenze beider Gelbereiche bewirkt. Als Elektrolyt diente ein Tris/Glycin-SDS-Gemisch. Für die Herstellung des Gels wurde zunächst das Trenngel erstellt, das zur Glättung der Oberfläche mit Isopropanol bedeckt und bis zur Aushärtung (Polymerisierung) des Gels so belassen wurde. Nach Abschluss der Polymerisierung wurde das Isopropanol entfernt und mit der Sammelgel-Lösung übergossen. Die Kämme für die Geltaschen wurden in dem noch flüssigen Sammelgel platziert und bis zum Abschluss der Polymerisation dort belassen. Im Anschluss wurden die Kämme entfernt und das Proteingemisch (enthält jeweils 35 µg Protein) 1:1 mit 2x Laemmli Sample Buffer vermischt und nach einer Inkubationszeit von mindestens 5 min in die Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese Kammer wurde mit Puffer (25 mmol/l Tris/Base, 250 mmol/l Glycin und 3,5 mmol/l SDS) aufgefüllt. Als Proteingrößen Standard wurden 3 µl des Precision Plus Protein all Blue Standard Bio Rad (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) eingesetzt. Bei zunächst 75 Volt kam es zu einer Konzentrierung der Proteinproben im Sammelgel. Nach ca. 15 min wurde die elektrische Spannung auf 100 Volt erhöht. Die Auftrennung der Proteine wurde beendet, wenn die Lauffront den unteren Rand des Gels erreichte.

Abbildung 7. SDS-PAGE und Proteintransfer. (A) Schematische Darstellung der Proteinseparation im SDS Page. Die Proteine werden im elektrischen Feld ihrer Größe nach aufgetrennt, wobei kleine Proteine weiter in Richtung Anode wandern als große Proteine.

Durch Bromophenolblau (im Ladepuffer) wird die Lauffront der Proteine sichtbar (blaue Linie). Die Pfeile geben die Laufrichtung der Proteine im Gel an. Nach Auftrennung der Proteine im Gel erfolgt der horizontale Transfer auf eine Nitrocellulose Membran. (B) Schichtung der Materialen während der Transfers.

2.2.5.4 Western Blot Transfer

Das Blot Verfahren dient dazu, die mittels SDS-PAGE entsprechend ihrer Größe aufgetrennten Proteine vom Gel auf eine Nitrocellulose-Membran zu transferieren, wo sie dauerhaft fixiert werden können.

Dazu wird ein elektrisches Feld angelegt, in dem die Proteine aus dem Gel auf die Nitrocellulose Membran wandern und dort fixiert werden. Zunächst werden alle Materialen in Transferpuffer getränkt, wobei sichergestellt wird, dass die flankierenden Halterungen vollständig luftblasenfrei sind. Es erfolgte eine Positionierung der Materialen wie in Abbildung 7B dargestellt. Wichtig dabei ist, dass gemäß der Wanderungsrichtung der Proteine die Nitrocellulose Membran zwischen Gel und Anode platziert wird. Das elektrische Feld wird nun senkrecht zu Membran und Gel angelegt. Die Blot-Kammer wird mit Transferpuffer (25 mmol/l Tris/Base, 200 mmol/l Glycin, 20% Methanol) aufgefüllt und eine Eistasche zur Kühlung des Puffers eingesetzt. Zusätzlich wird ein Stabrührer in der Kammer positioniert und diese auf einem Magnetrührer platziert. Eis und Stabrührer sollen während des Transfervorgangs die entstehende Wärme reduzieren und gleichmäßig verteilen. Der Transfer wird für 45 min bei 100 Volt durchgeführt. Im Anschluss wird die Membran zur Kontrolle eines erfolgten Transfers mit Ponceau S inkubiert, was eine reversible Anfärbung der gesamten, auf der Membran fixierten Proteine, erlaubt.

2.2.5.5 Immundetektion

Um interessierende Proteinbanden sichtbar zu machen, werden Primärantikörper verwendet, die spezifisch für das zu untersuchende Protein sind. Damit die Position der gebundenen Antikörper für das Auge erkennbar wird, folgt eine Inkubation mit einem zweiten Antikörper, der an den ersten Antikörper bindet und mit einer Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt ist. Die HRP katalysiert eine chemische Reaktion, bei welcher durch Zugabe von Luminol und Wasserstoffperoxid Licht emittiert wird (Abbildung 8A). Diese Reaktion wird mittels Röntgen Film detektiert. Die auf dem Film sichtbare Lichtreaktion entspricht dabei der Proteinposition auf der Membran. Um eine unspezifische Bindung des Primärantikörpers zu verhindern, wird die Membran zuvor für mindestens 20 min mit einer Magermilchpulver-Lösung inkubiert.

Durch diese Behandlung werden freie unspezifische Proteinbindungsstellen blockiert. Durch Auswaschen mit PBS wird überschüssiges Detergenz entfernt und der Primärantikörper in einem PBS Puffer (3% Milchpulver) aufgetragen und über Nacht bei 4 °C zur Inkubation auf einem Schwenkbrett belassen. Nach Entfernung der Primärantikörper-Lösung nach ca. 24 Stunden wird durch zweimaliges Waschen in PBS ungebundener Antikörper entfernt und der zweite Antikörper mit der gekoppelten Meerrettichperoxidase (1:2.000) in PBS Puffer (3%

Milchpulver) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sekundärantikörper-Lösung wird anschließend entfernt und die Membran weitere zweimal mit PBS gewaschen. Nach Entfernung von PBS wird 1 ml einer 1:1 Mischung von Luminol und Peroxidase auf die Membran aufgetragen und für 1 Minute geschwenkt, sodass die Membran von der Lösung vollständig bedeckt ist. Im Anschluss wird die Membran mit einer flachen Pinzette aus der Glasküvette geholt, zum Abtropfen der überschüssigen Lösung einige Sekunden gehalten, wonach sie in eine Filmkasette gelegt wird. Zur Aufnahme der Chemolumineszenz-Reaktion wird ein Röntgen Film auf die Membran in der Filmkasette gelegt und exponiert mit nachfolgender Filmentwicklung mittels Optimax Typ TR. Ein Beispiel eines Western Blot Ergebnisses ist in Abbildung 8B dargestellt.

Abbildung 8. Immundetektion und Visualisierung des Proteins. (A) Der spezifische Primärantikörper bindet das auf der Membran fixierte Protein. Ein unspezifischer Sekundärantikörper, an welchem eine Meerettichperoxidase (HRP) gekoppelt ist, bindet den Primärantikörper. Nach der Bindung wird eine Chemolumineszenz Reaktion in Gang gesetzt.

Das emittierte Licht schwärzt einen Röntgenfilm. (B) Beispiel eines fertigen Western Blot Ergebnisses. Das Protein TGF-β RII Phospho (70 kDa) in der Zelllinie UM-SCC-3 nach 24 h Inkubation ohne und mit 10 ng/ml TGF-β1.

2.2.6 Durchflusszytometrie

Mittels FACS-Analyse wurde die Expression des Proteins E-Cadherin in den Zelllinien HaCaT, UM-SCC-1, UM-SCC-3 und UM-SCC-22B nach Behandlung mit TGF-β1 beurteilt. Abhängig von der Menge an E-Cadherin in der einzelnen Zelle stellt diese Methode einen direkten Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und Proteingehalt der fixierten Zellen her. Da der Gesamtgehalt des Proteins zu beurteilen war, konnte dies an Ethanol fixierten Zellen untersucht werden. Das Wachstum der Zellen erfolgte bis eine Konfluenz von ca. 80% erreicht wurde. Hiervon wurden insgesamt 150x10³ Zellen in jedes Well einer 6-Well Schale aufgetragen. Zytokinkonzentration (10 ng/ml) und Inkubationszeit (Zeit=h) entsprechen der Darstellung in Tabelle 3 (siehe auch Kapitel 2.2.5). Zur Zellgewinnung wurden die Zellen mittels Trypsin vom Boden der Zellkulturschale gelöst und in einem Falkonröhrchen für 10 min bei 350 g zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstands wurde das Zellpellet in 500 µl kaltem PBS resuspendiert und unter ständigem vortexen in 4,5 ml kaltem (-20 °C) Ethanol (70%) fixiert. Vor der sich anschließenden FACS Messung wurde das zugeführte Ethanol entfernt.

Hierfür wurden die Zellen zentrifugiert und der Ethanol Überstand entfernt. Das Zellpellet wurde in 500 µl PBS resuspendiert, wonach zur restlichen Auswaschung des Ethanols der Waschvorgang einmal wiederholt wurde.

Anschließend erfolgte eine Aufteilung der Probe (250 µl PBS/Zell-Suspension pro FACS-Röhrchen). Ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin (PE) gekoppelter E-Cadherin-Antikörper (PE Mouse Anti-Human CD324 (E-Cadherin)-67A4 Isotype IgG1, κ) wurde in einer Verdünnung von 1:100 (in 250 µl PBS) eingesetzt. Als Isotyp Kontrolle diente PE Mouse Isotype IgG1, κ Control, welches in gleicher Menge in 250 µl PBS zugegeben wurde. Final befanden sich in jeder Probe 500 µl der PBS/Zellsuspension. Die Röhrchen wurden für eine Stunde im Dunkeln inkubiert und im Abstand von 5 min geschüttelt, um ein Absetzen der Zellen am Röhrchenboden und damit einhergehende ungleichmäßige Anfärbungen zu verhindern. Daraufhin folgte zur Auswaschung von überschüssigem nicht gebundenem Antikörper eine Zentrifugation bei 350 g und nach Entfernung des Überstands eine Resuspendierung des Zellpellets in 500 µl PBS. Die Röhrchen wurden abgedunkelt, auf Eis gelagert und bis zum Zeitpunkt der Messung dort belassen. Die FACS-Messungen erfolgten in der FACS Core Facility der Klinik für Hämatologie und Onkologie (Leiterin PD Dr. med.

C. Brendel), in freundlicher Zusammenarbeit mit Herrn Gavin Giel, am LSR II-Durchflusszytometer (Firma BD Bioscience). Vor Messung der einzelnen Proben, wurde jedes Röhrchen gevortext und anschließend am Vakuumseptum des LSR II fixiert. Zur Messung wurden die für den PE Farbstoff zugehörigen Exzitations- und Detektions-Wellenlängenkanäle am LSR II eingestellt. Es wurden 20.000 Zellen pro Probe detektiert. Die Datenauswertung erfolgte mit dem FACS-Analyse-Programm FlowJo v7.2.5 (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Anhand der Einstellung des Messfensters konnten mögliche Zelldupletten ausgeschlossen werden. Der prozentuale Anteil des Proteins wurde als relatives geometrisches Mittel der Fluoreszenzintensität (geometric mean fluorescence (GMF)) dargestellt.