Analyse der Hämatopoiese im Knochenmark Ptch-defizienter Tiere

624

561 731 451 513 554 649 315 464 391

646 Lsg.-behandelteKontrolle

Tam.-behandelteKontrolle E12.5

ntc tPtch

-/-15Tage

[bp]

β-Actin Pax5 wt Ptch Ptch^del Rag-2 Rag-1 EBF IL-7Rα Flt3 Ikaros PU.1

5

1 2 3 4 6

Abbildung 22: Die Inaktivierung von Ptch im adulten Tier führt im Knochenmark zum Verlust der Expression essentieller Transkriptionsfaktoren und Rezeptoren der B-Zell-Entwicklung.

RNA aus dem Knochenmark von zwei tPtch^-/- Mäusen 15 Tage nach der ersten Tamoxifengabe (Spur 1 und 2) und von jeweils einem Lösungsmittel- und Tamoxifen-behandelten Kontrolltier 15 Tage nach der ersten Injektion (Spur 3 und 4) wurde zur Expressionsanalyse mittels RT-PCR verwendet. Als Positivkontrolle für die jeweilige PCR wurde cDNA aus embryonaler RNA (E 12.5, der Embryo wurde 12,5 Tage nach der Kopulation entnommen) als Matrize verwendet (Spur 5). Bei der Negativkontrolle wurde anstelle von cDNA ddH2O verwendet (ntc, no template control) (Spur 6). Die verwendeten Oligonukleotidpaare sind in Tabelle 2 (4. Material und Methoden) aufgeführt und die amplifizierten Gentranskripte im Text beschrieben. Neben der Expressionsanalyse der aufgeführten für die Hämatopoiese relevanten Transkriptionsfaktoren und Rezeptoren wurde auch der Ptch Lokus analysiert. Der Nachweis von Ptch^del Transkripten in der RT-PCR-Analyse zeigt die effiziente Rekombination am Ptch Lokus im Knochenmark von tPtch^-/- Tieren 15 Tage nach der ersten Tamoxifengabe. Zur Überprüfung der eingesetzten cDNA wurden β-Aktin Transkripte amplifiziert.

Zur weiteren Definition des postulierten CLP-Defekts im Knochenmark von Ptch-defizienten Tieren wurde die Fraktion der Stamm- und Vorläuferzellen isoliert und durchflusszytometrisch analysiert. Sowohl HSC als auch die Vorläufer der lymphoiden und myeloiden Linie exprimieren keine linienspezifischen Oberflächenproteine und werden folglich unter dem Oberbegriff lineage-negative Zellen (Lin^-) zusammengefasst.

Die Aufreinigung der Lin^- Zellen des Knochenmarks erfolgte vor der FACS-Analyse durch Negativselektion unter Verwendung von Antikörpern (monoklonale Antikörper gegen folgende Mausantigene: CD5, CD11b/Mac-1, CD45R/B220, Ly-6G/Gr-1, TER119 und 7-4), die gegen Oberflächenproteine der liniendeterminierten hämatopoietischen Zellen gerichtet sind.

In der durchflusszytometrischen Analyse wurden im SSC/FSC dot plot in der Fraktion der kleinen, nicht-granulären Lin^- Knochenmarkszellen sowohl die HSC als auch die Vorläuferzellen der lymphoiden und myeloiden Linie erhalten (Abbildung 23, links) (Porse et al., 2005). Die weitere Differenzierung der verschiedenen Populationen der Stamm- und Vorläuferzellen Lin^- Knochenmarkszellen erfolgte durch die Expressionsanalyse der Rezeptortyrosinkinase c-Kit (Genprodukt des c-Kit Proto-Oncogens, CD117) und Sca-1 (stem cell antigen-1, auch als lymphocyte antigen 6 complex, locus A/E, Ly6A/E bezeichnet). Für die in einer Fraktion erfassten HSC und MPP ist eine simultan hohe Expression von c-Kit und Sca-1 charakteristisch (Lin^-c-Kit^highSca-1^high, Abbildung 23, Fraktion III). Die anschließende Differenzierung zu den Vorläuferzellen der myeloiden und lymphoiden Linie ist mit dem nahezu vollständigen Verlust der Expression von Sca-1 verbunden. Die Fraktion der CLP ist außerdem durch eine Reduktion der Expression von c-Kit gekennzeichnet (Lin^-c-Kit^lowSca-1^-/low, Abbildung 23, Fraktion II), wohingegen die Vorläufer der myeloiden Linie (MEP und GMP) weiterhin eine hohe Expression von c-Kit aufweisen (Lin^-c-Kit^highSca-1^-/low, Abbildung 23, Fraktion I) (Katayama et al., 1993; Okada et al., 1992; zur Übersicht: Metcalf, 1999). Außerdem sind die CLP in Fraktion II durch die zusätzliche Expression von IL-7Rα charakterisiert (Kondo et al., 1997).

Abbildung 23: Differenzierungsdefekt der lymphoiden Linie im CLP-Stadium des Knochenmarks von Ptch-defizienten Mäusen.

Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden Lin^- Knochenmarkszellen von tPtch -/-Mäusen 15 Tage (Mitte) und 19 Tage (unten) nach der ersten Tamoxifengabe sowie von einem Lösungsmittel-behandelten Kontrolltier 19 Tage nach der ersten Injektion (oben) verwendet. Dazu wurden Einzelzellsuspensionen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen die Oberflächenproteine c-Kit, Sca-1 und IL7-Rα inkubiert. Die Lin -Knochenmarkszellen wurden zunächst im SSC/FSC dot plot dargestellt (links). Die im SSC/FSC dot plot der Lin^- Knochenmarkszellen identifizierte Population der kleinen, nicht-granulären Zellen (Porse et al., 2005) wurde zur weiteren Charakterisierung im c-Kit/Sca-1 dot plot analysiert (Mitte und rechts). In rot sind alle Lin^- Knochenmarkszellen dargestellt (Mitte), zusätzlich sind die IL-7Rα⁺-Zellen in blau gekennzeichnet (Mitte und rechts). Fraktion I entspricht den Vorläufern der myeloiden Linie (Lin^-c-Kit^highSca-1^-/low), Fraktion II enthält die CLP-Population (Lin^-c-Kit^lowSca-1^-/low) und Fraktion III entspricht den HSC und MPP (Lin^-c-Kit^highSca-1^high). Die relativen prozentualen Anteile der markierten Populationen sind in den Bildern angegeben. Die abgebildeten Daten entsprechen einem repräsentativen Ergebnis von 3 unabhängigen Experimenten.

FSC

SSC

tPtch-/-19TagetPtch-/-15TageKontrolle

Sca-1

c-Kit

Sca-1

c-Kit

IL-7Rα⁺Zellen

0 1000 2000 3000 4000

0 1000 2000 3000 4000

FSC-A

SSC-A

48.4

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

64

14.8 12.5

0 1000 2000 3000 4000

FSC-A 0

1000 2000 3000 4000

SSC-A

33.1

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

33.5

28.5 7.82

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

35.8

42.3 6.79

0 1000 2000 3000 4000

FSC-A 0

1000 2000 3000 4000

SSC-A

34.9

48,4

33,1

34,9

22

15,8

53,5 I

II

III ^12,5

23,4

22,5

32,6 I

II

III

38,8

27,0

22,7 I

II

III

14,5

64,0 I

II

III

8,3

28,3

33,3 I

II

III

6,46

42,2

36,1 I

II

III

Die durchflusszytometrische Analyse von Lin^- Knochenmarkszellen zeigte, dass bei Ptch-defizienten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren sowohl die HSC/MPP-enthaltende Fraktion III (Lin^-c-Kit^highSca-1^high) als auch die Fraktion I der myeloiden Vorläufer (Lin^- c-Kit^highSca-1^-/low) in der relativen Zahl überrepräsentiert war (Abbildung 23, Mitte). Im Gegensatz dazu wurde eine deutliche Abnahme der durch eine geringe Expression von c-Kit und Sca-1 gekennzeichneten Fraktion II (Lin^-c-Kit^lowSca-1^-/low) detektiert, in der die CLP enthalten sind. Durch die zusätzliche Analyse der Expression von IL-7Rα konnte gezeigt werden, dass der fortschreitende Verlust der Fraktion II (Abbildung 23, Mitte) mit der Abnahme der Anzahl der CLP korreliert (Abbildung 23, rechts). Auf Basis dieser Daten kann geschlussfolgert werden, dass durch die Inaktivierung von Ptch ein Differenzierungsblock der frühen Vorläuferzellen der lymphoiden Linie induziert wird und das Entwicklungsstadium des CLP direkt betroffen ist. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass sich die Vorläuferzellen der myeloiden Linie in Ptch-defizienten Tieren bis 19 Tage nach der Induktion uneingeschränkt entwickeln.

Wie bereits bei den Analysen zuvor wurde auch bei der Charakterisierung von Lin -Knochenmarkszellen zu allen Experimenten Lösungsmittel- und Tamoxifen-behandelte Kontrolltiere mitgeführt. Dies ist besonders für die CLP (Fraktion II) essentiell, da dieses Zellstadium die unmittelbare Vorstufe der folgenden liniendeterminierten Zellstadien der B-Zellen im Knochenmark repräsentiert, für die im Rahmen dieser Arbeit ein negativer Effekt von Tamoxifen identifiziert wurde. Im Gegensatz zu den Populationen der B-Zellen in Knochenmark und Milz konnte aber für die direkten Vorläuferzellen in Fraktion II kein Einfluss von Tamoxifen auf diese Fraktion festgestellt werden (Abbildung 24 und 25).

Dies gilt sowohl für die beiden Analysezeitpunkte 15 und 19 Tage als auch für die separat anhand der Expressionsanalyse von IL-7Rα dargestellten CLP. Außerdem wurde in sämtlichen Analysen kein Effekt von Lösungsmittel oder Tamoxifen in Kombination mit einer aktiven Cre-Rekombinase auf die Fraktion III mit den HSC und MPP sowie der Fraktion I der myeloiden Vorläuferzellen detektiert.

Abbildung 24: Die Fraktionen Lin^- Knochenmarkszellen von Kontrolltieren sind 15 Tage nach der ersten Injektion unverändert.

Sca-1

c- Kit

tP tch

-/-

15 T ag e

Sca-1

c- Ki t

Tamoxifen-behandelte Kontrolle15TageLösungsmittel-behandelte Kontrolle15Tage

IL-7Rα

⁺

Zellen

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

33.5

28.5

23,4 7.82

22,5

32,6

I

II

III ^8,3

28,3

33,3

I

II

III

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

69

12 5.99

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

66

12

14,5 11.7

13,4

61,7

I

II

III ^11,7

12,0

66,0

I

II

III

11,9

14,7

63,0

I

II

III ^5,65

11,7

69,6

I

II

III

Die Lin^- Knochenmarkszellen von tPtch^-/- Mäusen 15 Tage nach der ersten Tamoxifengabe sowie von Lösungsmittel- und Tamoxifen-behandelte Kontrolltieren 15 Tage nach der ersten Injektion wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen c-Kit, Sca-1 und IL-7Rα inkubiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die im SSC/FSC dot plot identifizierten Populationen der Vorläufer wurden anhand der Expression von c-Kit und Sca-1 charakterisiert. Die gesamten Lin^- Knochenmarkszellen sind rot dargestellt (links), die IL-7Rα⁺-Zellen zusätzlich in blau (links und rechts). Fraktion I enthält die Vorläufer der myeloiden Linie (Lin^-c-Kit^highSca-1^-/low), Fraktion II die CLP-Population (Lin^- c-Kit^low Sca-1^-/low) und Fraktion III entspricht den HSC und MPP (Lin^-c-Kit^highSca-1^high). Die relativen prozentualen Anteile der markierten Populationen sind in den Bildern angegeben.

Die abgebildeten Daten entsprechen einem repräsentativen Ergebnis von 3 unabhängigen Experimenten.

Abbildung 25: Die Fraktionen Lin^- Knochenmarkszellen von Kontrolltieren sind 19 Tage nach der ersten Injektion unverändert.

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

78.7

6.67 2.08

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

75.2

11.1 7.78

Sca-1

c- Kit

tP tc h

-/-

19 T ag e

Sca-1

c- Ki t

Tam

oxifen-behandelte Kontrolle19TageLösungsmittel-behandelte Kontrolle19Tage

IL-7Rα

⁺

Zellen

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<FITC-A>

0 10² 10³ 10⁴ 10⁵

<PE-Cy7-A>

35.8

42.3

38,8 6.79

27,0

22,7

I

II

III ^6,46

42,2

36,1

I

II

III

12,7

11,6

67,0

I

II

III ^8,12

11,1

74,9

I

II

III

14,3

11,0

63,7

I

II

III ^2,08

6,67

78,8

I

II

III

Lin^- Knochenmarkszellen von tPtch^-/- Mäusen 19 Tage nach der ersten Tamoxifengabe sowie von Lösungsmittel- und Tamoxifen-behandelte Kontrolltieren 19 Tage nach der ersten Injektion wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen c-Kit, Sca-1 und IL-7Rα inkubiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die im SSC/FSC dot plot identifizierten Populationen der Vorläufer wurden anhand der Expression von c-Kit und Sca-1 charakterisiert. Die gesamten Lin^- Knochenmarkszellen sind rot dargestellt (links), die IL-7Rα⁺-Zellen zusätzlich in blau (links und rechts). Fraktion I enthält die Vorläufer der myeloiden Linie (Lin^-c-Kit^highSca-1^-/low), Fraktion II die CLP-Population (Lin^-c-Kit^low Sca-1^-/low) und Fraktion III entspricht den HSC und MPP (Lin^-c-Kit^highSca-1^high). Die relativen prozentualen Anteile der markierten Populationen sind in den Bildern angegeben.

Die abgebildeten Daten entsprechen einem repräsentativen Ergebnis von 3 unabhängigen Experimenten.

5.8 Expressionsanalyse essentieller Regulatoren der lymphoiden Linie in Lin

Im Dokument Der Hedgehog-Rezeptor Patched als molekularer Schalter der Hämatopoiese (Seite 76-83)