Analyse der Bindung von Anthranilsäure und/oder Tryptophan

mittels Titration

4.2.1.1.3.1 Bindung von Anthranilsäure

In der Röntgenstruktur von ssTrpD finden sich pro Untereinheit zwei Moleküle AA (Abbildung 15). Um zu untersuchen, ob AA an diese zwei Bindestellen mit unterschiedlicher Affinität bindet, wurden Titrationsstudien durchgeführt (3.5.8).

Hierzu wurde 1 µM Anthranilsäure vorgelegt, schrittweise Enzym zutitriert und die Änderung der Substratfluoreszenz nach Anregung bei 310 nm als Funktion der Enzymkonzentration gemessen. Abbildung 17A zeigt, dass die Emissionsspektren einen isoemissiven Punkt bei 382 nm aufweisen. In Abbildung 17B ist die aus der Intensitätsänderung bei 400 nm ermittelte Bindungskurve gezeigt, aus der sich durch den Fit mit einer hyperbolischen Funktion (Programm Sigma Plot 8.0) eine thermodynamische Dissoziationskonstante KdAA von 5,1 µM ergab. Da bei ansonsten identischen Bedingungen der KMAA bei 0,04 µM liegt (Tabelle 3), scheint die Affinität von ssTrpD für Anthranilsäure durch die Anwesenheit von PRPP etwa 100-fach erhöht zu werden. Eine alternative Erklärung für die Diskrepanz der beiden Werte ist, dass die Michaelis-Konstante für die Anthranilsäure kein zuverlässiges Mass für die Stärke der Bindung darstellt. Dies wäre der Fall, wenn in KMAA neben den Ratenkonstanten für die Bindung und die Abdissoziation von ssTrpD zusätzliche Ratenkonstanten der Reaktion in komplexer Weise mit eingehen (Fersht, 1999). Ob dies tatsächlich der Fall ist, kann momentan nicht entschieden werden.

Abbildung 17: Bindung von Anthranilsäure an ssTrpD-wt.

Die Messungen erfolgten bei 25°C in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 µM MgCl2. Es wurde 1 µM Anthranilsäure vorgelegt und schrittweise mit Enzym titriert.

A: Emissionsspektren der Anthranilsäurefluoreszenz nach Anregung bei 310 nm. Im Insert ist die nach jedem Titrationsschritt vorhandene Konzentration an ssTrpD angegeben.

B: Die Fluoreszenzänderung bei 400 nm ist aufgetragen gegen die Enzymkonzentration. Aus der Kurve wurde mittels Computerfit ein Kd-Wert von 5,1 µM ermittelt.

Auffällig ist, dass die Emissionsspektren in Abbildung 17A etwas von früher gewonnenen Spektren abweichen, wo der isoemissive Punkt statt bei 382 nm bei 395 nm lag (Deuss, 2002). Da die damaligen Messungen in 50 mM Hepes pH 8,0 aufgenommen wurden, die aktuellen jedoch in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, könnten die unterschiedlichen Puffersysteme und/oder der leicht veränderte pH-Wert für die Abweichungen verantwortlich sein. Die ermittelten Kd Werte liegen mit 5,1 µM (Abbildung 17) und 1,7 µM (Deuss, 2002) jedoch im gleichen Rahmen. In jedem Fall deuten die Existenz eines isoemissiven Punktes und der hyperbolische Verlauf der Bindungskurve darauf hin, dass nur zwei Spezies, gebundenes und ungebundenes Substrat, vorliegen und nur eine Art von Bindestelle existiert. Wie diese Befunde mit den Ergebnissen der Röntgenstrukturanalyse in Einklang gebracht werden könnten und welche der beiden gebundenen Anthranilsäuremoleküle vermutlich mit PRPP reagiert, wird in der anschließenden Diskussion (5.1) erörtert.

4.2.1.1.3.2 Bindung von Tryptophan

Obwohl es sich bei der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase nicht um das erste Enzym im Biosyntheseweg des Tryptophan handelt, wurde für TrpD aus Corynebacterium glutamicum eine feedback Inhibition durch Tryptophan nachgewiesen (O’Gara und Dunican, 1995). Daraus liesse sich schliessen, dass die „eigentliche“ Funktion einer der beiden Anthranilsäure Bindetaschen die Komplexierung von Tryptophan ist und AA sich dort unspezifisch angelagert hat.

Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Bindung von Tryptophan an ssTrpD durch Titrationsversuche untersucht (3.5.8.2). Dazu wurden 10 µM Tryptophan vorgelegt, Enzym schrittweise zutitriert und die Änderung der Ligandenfluoreszenz nach Anregung bei 295 nm als Funktion der Enzymkonzentration gemessen. Abbildung 18A zeigt, dass sich die Emissionsspektren in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration ändern und einen isoemissiven Punkt bei 330 nm aufweisen. In Abbildung 18B ist die aus der Intensitätsänderung bei 360 nm ermittelte Bindungskurve gezeigt, aus der sich durch den Fit mit einer hyperbolischen Funktion (Programm Sigma Plot 8.0) eine thermodynamische Dissoziationskonstante KdTrp von 6 µM ergab.

Abbildung 18: Bindung von Tryptophan an ssTrpD-wt.

Die Messungen erfolgten bei 25°C in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 µM MgCl₂. Es wurden 10 µM Tryptophan vorgelegt und schrittweise mit Enzym titriert.

A: Emissionsspektren der Tryptophanfluoreszenz nach Anregung bei 295 nm. Im Insert ist die nach jedem Titrationsschritt vorhandene Konzentration an ssTrpD angegeben.

B: Die Fluoreszenzintensität bei 360 nm ist aufgetragen gegen die Enzymkonzentration. Aus der Kurve wurde mittels Computerfit ein Kd-Wert von 6 µM ermittelt.

Die Existenz eines isoemissiven Punktes und der hyperbolische Verlauf der Bindungskurve deuten darauf hin, dass nur zwei Spezies, gebundenes und ungebundenes Tryptophan, vorliegen und nur eine Art von Bindestelle existiert.

Das Ergebnis legt eine spezifische Bindung von Tryptophan nahe. Es erlaubt jedoch nicht zu entscheiden, ob Tryptophan an die gleiche(n) Bindestelle(n) bindet wie AA. Um dies herauszufinden, wurde im Weiteren untersucht, ob Trp die Bindung von AA an ssTrpD erschwert.

4.2.1.1.3.3 Bindung von Anthranilsäure in Anwesenheit von Tryptophan

Es wurden 1 µM Anthranilsäure und 60 µM Tryptophan vorgelegt und schrittweise ssTrpD zutitriert. Die Bindung von AA wurde wiederum über die Fluoreszenzemission nach Anregung bei 330 nm verfolgt. Das Ergebnis ist in Abbildung 19A dargestellt.

Abbildung 19: Bindung von Anthranilsäure an ssTrpD-wt in Anwesenheit von Tryptophan.

Die Messungen erfolgten bei 25°C in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 µM MgCl2. Es wurden 1 µM Anthranilsäure und 60 µM Tryptophan vorgelegt und schrittweise mit Enzym titriert.

A: Emissionsspektren der Tryptophanfluoreszenz nach Anregung bei 330 nm.

B: Die Fluoreszenzintensität bei 380 nm ist aufgetragen gegen die Enzymkonzentration.

Im Gegensatz zur Titration in Abwesenheit von Trp, ist kein isoemissiver Punkt zu

In Abbildung 19B ist die aus der Intensitätsänderung bei 380 nm ermittelte Bindungskurve gezeigt, aus der sich durch den Fit mit einer hyperbolischen Funktion ein apparenter KdAA- Wert von 4 µM ergab, der annähernd dem gemessenen KdAA von 5,1 µM in Abwesenheit von Tryptophan entspricht (Abbildung 17B). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass AA und Trp verschiedene Bindestellen von ssTrpD besetzen. Sie stützen damit die Hypothese, dass eines der beiden in der Röntgenstruktur von ssTrpD identifizierten Anthranilatmoleküle unspezifisch an die Trp-Bindestelle gebunden hat. Die Aktivität von ssTrpD wird durch die Anwesenheit von Tryptophan nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt).