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Verbindungen absolutiert. Dafür wurde das Lösungsmittel einen Tag über Phosphorpentoxid zum Sieden erhitzt und unter Inertgas destilliert. Die Lagerung erfolgte unter Inertgas über Molsieb (4Å). CDCl3 wurde für das Vermessen säurelabiler Verbindungen durch basisches Aluminiumoxid neutralisiert.
Absolute Lösungsmittel
Für Reaktionen unter Feuchtigkeits- und/oder Sauerstoffausschluss wurden die nachstehenden Lösungsmittel wie angegeben erworben oder getrocknet. Zur Trocknung von Acetonitril, Dichlormethan, Diethylether, Pyridin, Tetrahydrofuran wurde auch eine MB-SPS 800-Lösungsmitteltrocknungsanlage der Firma MBraun verwendet.
Acetonitril (MeCN): a) Von Sigma-Aldrich (≤ 0.01% Wasser, über Molsieb) erworben.
b) Mehrere Tage über Calciumhydrid zum Rückfluss erhitzt, unter Inertgas destilliert und über Molekularsieb (3Å) gelagert.
c) Trocknung durch MB-SPS 800, über Molekularsieb (3Å) gelagert.
Dichlormethan (DCM): a) Von Sigma-Aldrich (≤ 0.005% Wasser, über Molsieb) erworben.
b) Trocknung durch MB-SPS 800, über Molekularsieb (4Å) gelagert.
Diethylether (Et2O): a) Von Sigma-Aldrich (≤ 0.005% Wasser, über Molsieb) erworben.
b) Mehrere Tage über Natrium/Benzophenon zum Rückfluss erhitzt, unter Inertgas destilliert und über Molsieb (4Å) gelagert.
c) Trocknung durch MB-SPS 800, über Molekularsieb (4Å) gelagert.
N,N-Dimethylformamid (DMF): Von Acros Organics (Extra Dry, ≤ 0.005% Wasser, über Molsieb) erworben.
Methanol (MeOH): Von Acros Organics (Extra Dry, ≤ 0.005% Wasser, über Molsieb) erworben.
Pyridin: a) Von Sigma-Aldrich (≤ 0.005% Wasser, über Molsieb) erworben.
b) Trocknung durch MB-SPS 800, über Molekularsieb (4Å) gelagert.
Tetrahydrofuran (THF): a) Mehrere Tage über Kaliumhydroxid vorgetrocknet, drei Tage über Kalium/Benzophenon zum Rückfluss erhitzt, unter Inertgas destilliert und über Molsieb (4Å) gelagert.
b) Trocknung durch MB-SPS 800, über Molekularsieb (4Å) gelagert.
Toluol: Von Acros Organics (Extra Dry, ≤ 0.005% Wasser, über Molsieb) erworben.
139 Chromatographie
7.1.5.1 Dünnschichtchromatographie
Zur Reaktionsverfolgung und Kontrolle der Säulenchromatographien wurden mit Kieselgel (Fluoreszenzindikator, 254 nm) beschichtete Aluminiumfolien (Macherey-Nagel ALUGRAM®
Xtra SIL G/UV 254, 0.2 mm Schichtdicke) verwendet. Die Laufstrecke betrug 4.1 cm. Alle Rf-Werte wurden bei Kammersättigung ermittelt. Die Detektion aller UV-aktiven Verbindungen erfolgte mit einer UV-Lampe bei Wellenlängen von 254 und 366 nm.
7.1.5.2 Anfärbereagenzien
Kaliumpermanganat-Lösung: Verbindungen mit Doppelbindung sowie ohne oder mit schwachem Chromophor wurden zusätzlich mit einem Gemisch aus Kaliumpermanganat, Kaliumbicarbonat, Natriumhydroxid und Wasser angefärbt.
Hanessian‘s-Stain: Einige Verbindungen wurden mit einer schwefelsauren Mischung aus Ammoniummolybdat und Cer(IV)-sulfat angefärbt.
Phosphathaltige Verbindungen: Phosphat- und phosphonathaltige Verbindungen wurden mit einer Mischung aus Hanessian’s stain (s.o.) und salzsaurer Zinn(II)-chlorid-Lösung angefärbt.
Vanillin-Schwefelsäure: Verbindungen mit mehreren Hydroxidfunktionen wurden mit Hilfe einer schwefelsauren Vanillinlösung angefärbt.
Iod: Verbindungen, bei denen die o.g. Anfärbereagenzien keine Reaktion hervorriefen, wurden in einer mit Iodgas gesättigten Kammer entwickelt.
7.1.5.3 Säulenchromatographie
Affinitätschromatographie: Für säulenchromatographische Trennungen wurde Kieselgel der Firma Macherey-Nagel (Kieselgel 60 M, 0.04-0.063 mm, 230-400 mesh) verwendet.
Größenausschluss-Chromatographie: Für säulenchromatographische Trennungen wurde Sephadex® LH-20 der Firma Sigma oder GE Healthcare verwendet.
Umkehrphasenchromatographie (RP18-Chromatographie): Für die Reversed-Phase-Chromatography wurde Polygoprep® 100-50C18 der Firma Macherey-Nagel als stationäre Phase verwendet.
7.1.5.4 Zirkuläre präparative Dünnschichtchromatographie (Chromatotron®):
Unter Verwendung eines Chromatotrons® der Firma Harrison Research, Modell 7924 T, wurden Substanzgemische mit Rohausbeuten von bis zu 4 g chromatographiert. Als Trennmittel diente
140
gipshaltiges Kieselgel 60 PF254 (Merck Nr. 7749) in Schichtdicken von 1, 2 oder 4 mm auf Glasplatten (Durchmesser: 20 cm). Die Detektion erfolgte mit einer UVLampe bei einer Wellenlänge von 254 nm.
Spektroskopie und Massenspektrometrie 7.1.6.1 Kernresonanzspektroskopie (NMR):
Die bei Raumtemperatur erstellten NMR-Spektren wurden in der spektroskopischen Abteilung des Instituts für Organische Chemie sowie des Instituts der Anorganischen Chemie des Departments Chemie an der Universität Hamburg aufgenommen. Hierfür wurden die folgenden Geräte genutzt: Varian Gemini 2000BB, Bruker Fourier 300, Bruker AMX 400, Bruker DRX 500 und Bruker AVIII 600. Die chemische Verschiebung δ [ppm] wurde auf die Lösungsmittelsignale bezogen, wobei CDCl3 auf 7.26 ppm (1H) bzw. 77.16 ppm (13C), D2O auf 4.79 ppm (1H), DMSO-d6 auf 2.50 ppm (1H) bzw. 39.52 ppm (13C), MeOD-d4 auf 3.31 ppm (1H), CD3CN auf 1.94 ppm (1H) bzw. 49.00 ppm (13C) kalibriert wurden. Messungen in Gemischen aus CDCl3/MeOD/D2O wurden auf Methanol gelockt und wie diese o.g. kalibriert. Bei allen 31P-Spektren wurden die Signale zur Kalibrierung gegen einen externen 85%igen Phosphorsäurestandard angegeben.
7.1.6.2 Infrarotspektroskopie (IR):
Die Messungen der IR-Spektren wurden an einem Alpha-P FT-IR-Spektrometer der Firma Bruker bei Raumtemperatur in einem Messbereich von 400-4000 cm-1 aufgenommen. Die Verbindungen wurden als Reinsubstanzen durch abgeschwächte Totalreflexion (ATR) vermessen.
7.1.6.3 Massenspektrometrie (MS):
Die Massenspektren wurden in der massenspektrometrischen Abteilung des Instituts für Organische Chemie der Universität Hamburg aufgenommen. Die EI-Massenspektren wurden an einem VG 70S EI doppelt fokussierenden Sektorfeldmassenspektrometer der Firma VG Analytical gemessen. Die hochaufgelösten (HR: high resolution) ESI-Messungen im negativen wie auch positiven Modus wurden an einem Agilent 6224 ESI-TOFMassenspektrometer der Firma Agilent Technologies durchgeführt. Die MALDI-Messungen erfolgten an einem Bruker UltrafleXtreme™
MALDI-TOF-TOF-Spektrometer, wobei 9-Aminoacridin (9AA) und 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) als Matrix dienten.
141 Weitere Geräte
7.1.7.1 Gefriertrocknung
Wässrige Lösungen wurden an einer Christ Alpha 2-4 LDPlus Gefriertrocknungsanlage in Kombination mit einer Drehschieberpumpe der Firma Vacuubrand lyophylisiert.
Zur Gefriertrocknung der immunbiologischen Proben wurde eine Lyovac GT2 der Firma Leybold-Heraeus verwendet.
7.1.7.2 Reinstwasseranlage
Reinstwasser (Milli-Q) wurde durch ein arium® pro UV-Reinstwassersystem der Firma Sartorius bzw. bei den immunbiologischen Tests durch eine Water Distillation Unit 2004 der Firma GFL gewonnen.
7.1.7.3 Ultraschallbad
Das Entgasen und Durchmischen von HPLC-Lösungsmitteln sowie das spezielle Behandeln von Hydrolyselösungen und Suspensionen erfolgte mit dem Ultraschallbad Sonorex RK512H der Firma Bandelin.
Bei den immunbiologischen Arbeiten wurde Sonorex Super der Firma Bandelin verwendet.
7.1.7.4 Zentrifugation
Bei den Synthesen wurde zum Zentrifugieren eine eppendorf Centrifuge® 5418 R bei 14000 Umdrehungen/min bzw. eine IKA mini G eingesetzt.
Bei den immunbiologischen Arbeiten wurde zum Zentrifugieren eine eppendorf Centrifuge® 5810 R verwendet.
Immunbiologische Arbeiten 7.1.8.1 Geräte
Fluoreszenzmikroskopie Evos FL Auto der Firma Life Technologies
IFN-γ-ELISA-Reader ELISA-Reader MRXII der Firma Dynex Technologies
FACS LSR II der Firma BD Bioscience
Real-time PCR Rotor-Gene RG-3000 der Firma Corbett Research
142
7.1.8.2 Kits und Reagenzien
Humaner IFN-γ-ELISA ELISA MAX® Standard SET Human IFNγ der Firma Biolegend Muriner IFN-γ-ELISA ELISA IFN-γ murin der Firma R&D
qPCR-Kit Systems KAPA PROBE FAST Universal der Firma peqlab Zombie UV® FixableViability Kit BioLegend
Accutase PAN Biotech
Bicoll Biochrom AG
Bovines Serum Albumin Serva Electrophoresis GmbH
Gentamycin PAA Laboratories GmbH
IMDM Sigma-Aldrich
PMA Sigma Aldrich
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN
RPMI 1640 Gibcoby Life Technologies
Waschpuffer Perm/Wash-Buffer der Firma BioLegend X-VIVO® 15 (Mit Gentamycin) Lonza Group Ltd.
7.1.8.3 Verbrauchsmaterial
Platte für Anti-Leishman.-Assay 8-well Nunc® Lab-Tek chamber slide
ELISA-Mikrotiterplatte High-Binding 96-Well ELISA Mikrotiterplatte der Firma Greiner bio-one
Kultivierungsplatten TPP® tissue culture plates 6-well flat bottom (6 Wells) bzw.
Greiner bio-one (96 Wells)
Kulturflaschen Produkte der Firmen Becton Dickenson oder Sarstedt
Neubauer-Zählkammer Tiefe 0.1 mm, Fläche 2.5 μm2, der Firma Marienfeld-Superior
ZellScraper Sarstedt
7.1.8.4 Puffer und Lösungen
ELISA-Substratpuffer 0.1 M NaH2PO4, pH 5.5
143 ELISA-TMB-Stammlösung DMSO, 25 mM TMB
ELISA-Substratlösung 98.35% ELISA-Substratpuffer, 1.64% ELISA-TMB-Stammlösung, 0.01% H2O2 (30%)
NaPBS 6.7 mM Na2HPO4, 3.3 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.2 PBS 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl PBS/1% BSA 1% BSA in PBS, steril filtriert, Lagerung bei -20°C
ELISA-Blockpuffer NaPBS, 2% FCS 7.1.8.5 Medien
RPMI-Medium: 500 mL RPMI 1640, 50 ml FCS, 5 mL L-Glutamin, 5 ml Natriumpyruvat, 500 µL β-Mercaptoethanol (Stock: 100 ml 0.9% NaCl+70 µl β-Mercaptoethanol), 2.5 ml Gentamycin (50 µg/mL)
IMDM: 55% IMDM (ohne Glutamin), 10% inaktiviertes FCS (30 min, 56°C), 5% Pferdeserum, 30% Überstand von L929 Zellen, 20 µg/mL Gentamycin
RPMI+ (für THP1) 88% RPMI-1640 mit 25 mM HEPES, 10% FCS, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin
IMDM+ 87,5% RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-Glutamin, 1%
Natriumpyruvat, 0,5% β-Mercaptoethanol (Stock: 100 ml 0,9%
NaCl + 70 µl β-Mercaptoethanol), 50 µg/mL Gentamycin X-VIVO® 15-Medium X-VIVO® 15 Medium, 1% Penicillin/Streptomycin 7.1.8.6 Zellzahlbestimmung
Die Bestimmung der Zellzahl wurde mithilfe einer Neubauer-Zählkammer (Neubauer, Tiefe 0.1 mm, 2.5 μm2, Marienfeld, Deutschland) durchgeführt. Je 10 µL einer Zellsuspension von geeigneter Verdünnung (1:10 bis 1:100, v/v) in Trypanblau (Trypanblau 0.4%, Gibco, 1:10, v/v, verdünnt in PBS) wurden verwendet, vier Großquadrate der Zählkammer ausgezählt und die Zellzahl pro Milliliter bestimmt. Die Zellen wurden im Vornherein mit Trypanblau gefärbt, um die Unterscheidung lebender und toter Zellen zu ermöglichen. Zur Zellzahlbestimmung wurden jeweils nur lebendige Zellen gezählt.
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7.1.8.7 Statistische Analysen
Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe der Software PRISM® 6 der Firma Graphpad durchgeführt. Für die Bestimmung der Signifikanz wurde der unpaired Student’s t-test verwendet.
7.1.8.8 Erreger
Leishmania major: Die in dieser Arbeit verwendeten Leishmanien wurden von der Arbeitsgruppe Clos, BNITM, zur Verfügung gestellt. Infektion von murinen oder humanen Makrophagen wurden mit dem Isolat Leishmania major, 5ASKH (MHOM/TM/1973/5ASKH) durchgeführt.
Mycobacterium tuberculosis: Es wurden Mykobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) des Typs H37Rv (ATCC 27294) verwendet, die vom Forschungszentrum Borstel (Arbeitsgruppe von Dr.
Christoph Hölscher) zur Verfügung gestellt wurden.
7.1.8.9 Mäuse
In dieser Arbeit wurden die Zellen von Hausmäusen der Art Mus musculus (Linneaus, 1958) verwendet. Alle murinen Zellen stammen von Mäusen aus Hauszucht des Bernhard-Nocht-Instituts für Tropenmedizin in Hamburg. Es handelt sich bei allen Mäusen um 8-14 Wochen alte Weibchen des Wildtyp-Mausstammes C57BL/6J. Die Tierversuche wurden unter den Voraussetzungen nach §8 des Tierschutzgesetzes Deutschland durch die Behörde für Gesundheit und Verbraucherschutz Hamburg genehmigt (46/13; 133/13)